二氧化碳还原用甲酸脱氢酶的研究进展
《精细化工》
2023年 40卷
第10期
20221145
中图分类号：X701；TQ426.97
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摘要
CO 的还原和资源化利用是缓解温室效应的重要手段。生物催化剂对反应和底物具有高选择性，因此被用于构建高效的CO 还原系统。其中，甲酸脱氢酶（FDH），特别是某些烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）依赖型/金属辅因子（W 或Mo）的甲酸脱氢酶，能够可逆地将CO 还原成甲酸盐。该文首先介绍了甲酸脱氢酶的特性及分类，其次综述了CO 还原用甲酸脱氢酶的活性位点及催化机制、FDH 的分子改造、全细胞生物催化CO还原为甲酸盐的最新进展，为CO 还原用生物催化剂的研究提供了启示，为以CO 为原料构建可行的CO 还原系统来生产增值的燃料和化学品提供了理论基础。
关键词: 甲酸脱氢酶 CO [ { "name": "text", "data": "2" } ] 酶工程 全细胞催化 甲酸盐
自工业革命以来，热力发电、交通运输等行业排放了大量的CO 2 ，从而导致气候变化和全球变暖。为了降低大气CO 2 水平，不仅实施了《巴黎气候协定》等法规，还开发了包括CO 2 捕获、储存和利用在内的新技术 。CO 2 是一种廉价、丰富和可再生的碳原料，可用于燃料和化学品的合成，如甲酸、甲醇、乙醇等 。因此，将CO 2 转化为燃料和化学品为缓解全球变暖和促进可再生能源利用提供了一种双赢战略 。
在过去的几十年里，人们对CO 2 的转化进行了深入的研究，包括化学转化、电化学转化和光化学转化 。然而，这些方法都存在各自的缺陷，阻碍了大规模的应用。化学转化通常在高温高压等条件下进行，需要使用价格昂贵的催化剂，进而导致高能源消耗和高成本。光化学转化需要光敏剂长时间光照，具有不稳定和下游产物难分离的问题 。电化学转化通常存在选择性低、产物种类多、电流密度低、效率低的问题 。与上述方法相比，酶法转化CO 2 是一种很有前途的解决方案，它可以在温和环保的条件下实现高选择性和高效率的CO 2 还原 。酶法CO 2 转化是利用甲酸脱氢酶（FDH）、甲醛脱氢酶（FaldDH）和醇脱氢酶（ADH）等多酶级联反应来生产一些重要的化学品和燃料，CO 2 伴随着还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化分别还原为甲酸、甲醛和甲醇，如 图1 所示 [10-11] 。
图1 3 种脱氢酶催化CO
长期以来，人们认为FDH 是一种几乎不可逆催化甲酸盐氧化成CO 2 的酶 [12-13] 。最新研究表明，某些FDH 能够可逆地将CO 2 还原成甲酸盐 ，也有学者致力于开发电酶法CO 2 精炼系统生产甲酸盐，将CO 2 转化为一种重要的化工原料 。
本文综述了CO 2 还原用甲酸脱氢酶的最新研究进展，讨论了最近发现的甲酸脱氢酶（作为CO 2 还原酶）的CO 2 还原活性及其机制、酶分子的改造、全细胞生物催化和多酶级联反应。基于对CO 2 还原酶的研究，可以构建可行的、非光合作用的CO 2 还原系统，从而利用CO 2 生产增值的燃料和化学品。
1 甲酸脱氢酶的特性及分类
FDH 作为一种生物催化剂，催化甲酸盐氧化为CO 2 ，将电子传递给氧化型辅酶（S ox ），或者反向将CO 2 还原为甲酸，将电子传递给还原型辅酶（S red ），如式（1）所示 。
根据所依赖的辅酶类型，FDH 分为四类：烟酰胺〔NAD(P) + 或NAD(P) + /金属辅因子〕依赖型、细胞色素（细胞色素b1 或细胞色素c553）依赖型、醌辅酶依赖型和NAD + -铁氧还蛋白依赖型。此外，根据是否含有金属辅因子，FDH 又可分为单纯NAD(P) + 依赖型和NAD(P) + /金属辅因子依赖型。单纯NAD(P) + 依赖型FDH 在活性中心不包含金属簇；NAD(P) + /金属辅因子依赖型FDH 的活性中心有一个金属簇，这些 FDH 不仅可以利用天然辅因子〔NAD(P) + /NAD(P)H〕进行甲酸盐氧化/CO 2 还原，而且可以利用人工电子受体/供体进行反应。NAD(P) + 依赖型FDH、醌型FDH 和NAD(P) + -铁氧还蛋白依赖型FDH 3 种酶在酶的国际系统分类编号分别为EC1.17.1.9、EC1.17.5.3 和EC1.17.1.11，而细胞色素依赖型FDH 分为两种：细胞色素b1 依赖型FDH（EC1.2.2.1）和细胞色素c553 依赖型FDH（EC1.17.2.3） 。
在此对目前已报道的一些具有CO 2 还原活性的FDH 进行了比对分析，结果如 表1 所示。
表1 具有CO
由 表1 可知，与NAD(P) + /金属辅因子依赖型FDH 相比，NAD(P) + 依赖型FDH 对CO 2 还原的催化效率相对较低。此外，FDH 催化甲酸盐氧化的效率通常高于其还原CO 2 的效率。从 Candida boidinii 中获得的NAD + 依赖型的 Cb FDH 已被广泛用于各种光诱导CO 2 还原制备甲酸的反应中，而 Cb FDH 主要通过NAD + 还原偶联的方式催化甲酸盐氧化生成CO 2 。相比之下，CHOE 等 报道了一个来源于 Thiobacillus sp.KNK65MA 的 Ts FDH 具有优异的催化 CO 2 还原的活性，其对 CO 2 还原的催化效率（ k cat / K m 值，下同）为0.035 L/(mmol∙s)，而 Cb FDH为0.0005 L/(mmol∙s)，是后者的70 倍。分别用 Ts FDH和 Cb FDH 催化CO 2 气体制取甲酸盐， Ts FDH 的甲酸盐产率是 Cb FDH 的5.7 倍。序列和结构比较表明，具有较高催化CO 2 还原活性的FDH 具有较长的N-末端和C-末端 [16,31] 。此外，1 个来源于 Myceliophthora thermophile 的 Mt FDH，尽管它催化甲酸盐氧化的 k cat 值高于CO 2 还原的值，但是它催化CO 2 还原的 K m 值显著低于其催化甲酸盐氧化的 K m 值，因此，其CO 2 还原的催化效率〔0.23 L/(mmol∙s)〕是甲酸盐氧化效率〔0.04 L/(mmol∙s)〕的5.8 倍 。
在NAD(P) + /金属辅因子依赖型FDH 中，一些来自大肠杆菌、坏死杯状菌和脱硫弧菌等含金属辅因子的FDH，对CO 2 还原的转化率没有对甲酸盐氧化的转化率高 [12,22,24-25] 。但是，MIN 等 从 Rhodobacter aestuarii 中发现了一种新型含钼的 Ra FDH，其对于CO 2 还原和甲酸盐氧化的 k cat 值分别为0.81 和0.26 s –1 ，表明该酶驱动的CO 2 还原速率超过了该酶驱动甲酸盐氧化的速率 。1 个来源于 Syntrophobacter fumaroxidans 的 Sf FDH 对CO 2 还原表现出了较高 k cat 值（500 s –1 ） 。ÇAKAR 等 报道了来源于 Clostridium ljundahlii 的FDH（ Cl FDH），其在钨和钼的存在下，活性分别比不含钨和钼的情况下提高了2.8 倍和5.6 倍。因此， Cl FDH可能是一种NAD(P) + / 金属辅因子依赖型酶。KUK 等 进行了随机ICP-MS 分析，证明每个 Cl FDH 亚单位有1.28 个钨，说明 Cl FDH 是一种依赖NAD + 并且含金属钨的酶。OLIVEIRA 等 根据 Desulfovibrio vulgaris Hidenborough 中的 Dv FDH，构建了一个重组的含钨的甲酸脱氢酶（FdhAB，含有两个不同亚基A 和B 的FDH），表现出显著的O 2 稳定性。此外， Dv FDH 表现出非常高的CO 2 还原活性，其 k cat 值为315 s –1 ， k cat / K m 值为750 L/(mmol∙s)。
根据文献报道，一些NAD + 依赖型FDH 的 T m 值（即热处理后初始酶活性损失50%时的温度）在45～65 ℃之间，与酵母和植物来源的FDH 相比，细菌来源的FDH 更稳定 [32-34] 。细菌FDH 的N 端有一个较长的Loop 环，但酵母和植物FDH 中没有。该Loop 环包含大量的脯氨酸残基，刚性较强，该区域与亚单位的多种相互作用是细菌FDH 热稳定性较高的原因 。
由 表1 可见，CO 2 还原效率较高的3 个来源于 S.fumaroxidans 、 D.vulgaris 和 D.desulfuricans 的甲酸脱氢酶均是NAD(P) + /金属辅因子依赖型FDH。因此，后续研究如果是以CO 2 固定还原为目标的工作，可以重点围绕金属辅因子依赖型FDH 开展。
2 甲酸脱氢酶的活性位点及其催化机制
近年来，许多科研工作者都在尝试通过基因工程和酶工程的手段对FDH 进行定向改造，以提高其CO 2 的还原活性。而充分了解FDH 的结构和催化机制，可大大提高酶改造效率。对于 NAD + 依赖型FDH，其活性中心仅由氨基酸残基组成。如 图2 a 所示，其活性中心通常由8 个氨基酸（Ile、Asn、Thr、Arg、Asp、Gln、His 和Ser，其中Ile 为异亮氨酸；Asn 为天冬酰胺；Thr 为苏氨酸；Arg 为精氨酸；Asp为天冬氨酸；Gln 为谷氨酰胺；His 为组氨酸；Ser为丝氨酸）构成底物和辅因子结合位点 。
图2 NAD
碱性氨基酸残基（组氨酸和精氨酸）形成甲酸或CO 2 的结合部位，苏氨酸、天冬氨酸和组氨酸等氨基酸残基通过氢键形成NAD + 或NADH 的结合位点 [35-36] 。NAD + 依赖型FDH 通过捕获NAD + 的胺基上的氢和羰基氧来启动甲酸盐氧化。然后，带正电荷的Arg 和带负电荷的甲酸盐被静电俘获，活性中心催化甲酸盐氧化为CO 2 ，NAD + 还原为NADH [15,37] ，见 图2 b。
金属辅因子依赖型FDH 通常含有高度保守的活性位点，其中包括1 个Mo（或W）配位中心，由两个钼蝶呤二核苷酸分子、1 个硫化物和1 个硒-半胱氨酸配体组成。此外，在第二配位中心还有组氨酸和精氨酸残基 。 图3 a 和b 分别是含钼和含钨的金属辅因子依赖型FDH 活性中心的可能结构。在甲酸盐氧化和CO 2 还原反应中，金属辅因子依赖型FDH 活性中心结构有所不同。对于甲酸盐氧化反应，Mo 或W 的价态为六价，Mo 或W 与硫化物的键合状态为“X==S(X=Mo 或W)”。相反，在CO 2 还原反应中，Mo 或W 的价态为四价，Mo 或W 与硫化物的键合状态为“X—SH(X=Mo 或W)” [15,39] 。
图3 金属辅因子依赖型FDH 活性中心含Mo（a）和W（b）的可能结构
对于金属辅因子依赖型FDH，甲酸盐氧化反应的可能机制如 图4 a 所示。首先，带负电荷的甲酸盐被带正电荷的精氨酸残基静电捕获。其次，甲酸的氢攻击与金属（X=Mo 或W）结合的硫原子，从而使金属X 的价态从六价降为四价。最后，基于释放的质子和CO 2 ，金属X 的价态从四价氧化为六价，活性中心恢复到原来的状态。CO 2 还原反应的可能机制如 图4 b 所示。首先，CO 2 被带正电荷的精氨酸残基静电捕获。其次，与金属（X=Mo 或W）结合的硫醇的氢攻击被精氨酸残基捕获的CO 2 ，从而金属X 的价态从四价氧化为六价。最后，由于接受质子和电子并且释放出甲酸盐，金属X 的价态从六价又还原为四价，活性中心恢复到原来的状态 。从催化机制可以推测，金属辅因子依赖型FDH 中金属X 价态的变化有助于活性中心催化残基的电子传递，能够显著提高活性中心催化残基的催化效率，进而表现出比非金属辅因子依赖型FDH 更高的二氧化碳还原效率。
图4 金属辅因子依赖型FDH 可能的氧化还原机制：甲酸盐氧化（a）、CO
3 甲酸脱氢酶的分子改造
在CO 2 还原为甲酸盐的各种反应途径中，利用FDH 生物催化是最好的选择。然而，FDH 操作稳定性不好，限制了其在CO 2 还原反应中的应用。为此，研究者试图对FDH 进行分子改造，旨在提高其化学和热稳定性、催化活性、辅酶专一性以及在大肠杆菌中的表达效率。本节简要介绍了通过分子改造获得高效突变体的最新成果，并提出了未来可继续开展的工作设想。
WU 等 对 Candida boidinii 来源的FDH 进行了Asp195、Tyr196 和Gln197 残基的定点饱和突变，获得了两个NADP + 依赖型FDH 突变体。对NADP + 的催化效率分别为1.14×10 4 和2.9×10 3 L/(mol∙s)，这两个突变体的催化效率高于来自 C.boidinii 的通过顺序诱变获得的突变体。说明这些残基对FDH 辅因子的特异性有重要影响，该研究向着开发高效NADP + 依赖型FDH 目标更进一步。PALA 等 报道了一种来源于 Chaetomium thermophilum 的NAD + 依赖型FDH（ Ct FDH），通过活性位点突变增强了CO 2 还原活性。突变体N120C 具有完全灭活的甲酸盐氧化活性，其对HC 的还原比活是野生型（未突变）的4.7 倍。突变体的催化转化率（ k cat 值）是野生型的6.5 倍，但底物结合能力（ K m 值）降低了6.5 倍，总体上对HC 的还原具有相同的催化效率。通过分子模拟解析突变体活性增强的分子机制，结果表明：（1）突变体放松了对底物定位和活性中心构象柔性的严格控制，从而导致底物亲和力减弱；（2）突变体与底物HC 之间的氢键改善了氢化物转移机制，从而提高了催化转化率 。ÇAKAR 等 通过对 Ct FDH 进行定向进化，获得了4 株能提高HC 催化转化率的突变体。突变体G93H/I94Y 表现出较高的催化转化率和较强的底物结合能力，总体上其催化效率比野生型高5.4 倍。突变体G93H/I94R的催化转化率是野生型的2.6 倍，但底物亲和力比野生型低2.3 倍，因此，突变体和野生型的催化效率相差不大。突变体（R259C 和G93H/I94Y/R259C）的催化转化率有所提高，但底物亲和力显著减弱，从而导致催化效率低于野生型。将突变酶与底物进行分子对接，结果表明，突变体（G93H/I94Y）引起了辅因子位置的轻微变化，这可能导致氢从NADH 快速转移到HC （如 图5 所示），从而提高了催化转化率和总催化效率。此外，ÇAKAR 等还证实了突变体G93H/I94Y 可与醇脱氢酶共同用于NAD + 的再生系统 。
图5 HC
迄今为止，针对NAD + 依赖型FDH 的分子改造研究并不多，改造效果也并未达到可用于生产的水平。在今后研究中，可以基于大数据分析，充分利用AlphaFold 2.0、ProtENN 深度学习等人工智能技术，进一步提高甲酸脱氢酶三维结构模拟的精确度、准确度和速度，为甲酸脱氢酶的辅酶选择性、稳定性和催化活性的理性改造提供坚实的基础。再借助全质粒扩增、无缝克隆等现代分子生物学技术，快速实现甲酸脱氢酶特定位点的定点突变，高效获得性能优良的甲酸脱氢酶突变体，显著提高其还原CO 2 的能力，助力实现“碳中和、碳达峰”的“双碳”目标。
4 全细胞生物催化CO
基于对FDH 的研究，人们还尝试了全细胞生物催化法利用CO 2 生产甲酸盐。SCHUCHMANN 等 报道了来自 Acetobacterium woodii 的一个依赖H 2 的含钼甲酸脱氢酶，在其催化下以合成气为原料，生产了25 mmol/L 的甲酸盐，催化CO 2 还原所需电子由H 2 氧化提供。酶催化生产甲酸盐的产量比用碳酸氢钠、CO 2 和H 2 混合物的产量低 [23,42-43] ，可能是由于合成气中CO 和其他成分的抑制作用。ALISSANDRATOS等 试图在大肠杆菌JM109中过量表达来自 Clostridium carboxidovoran s、 Methanobacterium thermoformicicum 或 Pyrococcus furiosus 的FDH，以制备用于生产甲酸盐的全细胞生物催化剂。在建立的大肠杆菌工程菌中，过量表达 Pf FDH 的菌株利用碳酸氢钠和气态氢生产出44 mmol/L的甲酸盐，其产率为22.7 mmol/(L∙h) 。为了开发一种将 CO 2 转为甲酸盐的生物工艺，MOURATO 等 发现了一种 D.desulfuricans 菌株表现出很高的催化性能，在批量反应器中生产出12 mmol/L 的甲酸盐，产率为0.09 mmol/(L∙h)。他们接下来构建了一个利用CO 2 生产甲酸盐的连续反应器，实现了 45 mmol/L 的甲酸盐产量，产率为0.4 mmol/(L∙h)。并且提出了一个生产甲酸盐的代谢途径，胞质中的甲酸脱氢酶（FdhAB）利用氢化酶（HydAB）驱动的H 2 氧化所产生的电子催化CO 2 还原为甲酸盐（见 图6 。所提出的代谢途径有助于进一步设计工程菌株，以从CO 2 中高效生产甲酸盐。
图6 外周FDH 利用H
最近，SCHWARZ 等 从 Themoanaerobacter kivui 中分离并鉴定了1 个嗜热且依赖H 2 的甲酸脱氢酶，在70 ℃下，CO 2 还原和甲酸盐氧化的转化率分别为9.6×10 6 和9.9×10 6 h –1 。进一步采用该酶全细胞生物催化CO 2 还原制备甲酸盐，产量达130 mmol/L，产率高达270 mmol/(L∙h)，并且不产生任何副产物 。该酶良好的热稳定性使其成为一种非常有前景的全细胞生物催化剂，可进一步应用于储氢和工业废气转化为甲酸盐。
5 多酶级联系统的开发
早期，OBERT 等 报道一种通过3 种脱氢酶将CO 2 转化为甲醇的多酶级联反应方法，该酶促级联系统由甲酸脱氢酶（FDH）、甲醛脱氢酶（FaldDH）和醇脱氢酶（ADH）组成，并以NADH 作为终端电子供体 。这种多酶级联生物催化CO 2 的还原非常有吸引力，不但能减少CO 2 的排放，还可以生产出由石油衍生的化学品。此外，该反应可以在温和的条件下进行，尤其可以在低温下进行。然而，由于酶促级联系统中每步反应都需要1 mol 的辅因子NADH，大大增加了生产成本。因此，需要通过各种技术实现辅因子的再生，包括将酶系统纳入化学和光化学 、电化学 或生物电化学 [48-49] 系统中。其中，实现NADH 再生最常见的方法是通过添加第二种酶和第二种底物，将辅因子由氧化形式（NAD + ）转化为还原形式（NADH） [50-51] 。除了能降低成本外，辅因子的回收可以防止辅因子对酶的抑制 。MARPANI 等 在CO 2 转化为甲酸的多酶级联系统的最后一步ADH 的催化反应中，选择了原位NADH辅因子再生。该研究联合使用了两个系统：系统Ⅰ包含ADH 和葡萄糖脱氢酶（GDH），系统Ⅱ包含ADH 和木糖脱氢酶（XDH），见 图7 。每个系统循环反应得到的产品（分别为葡萄糖酸和木糖酸）都是合成高价值化学品和燃料很关键的前体物 。该系统为CO 2 转化的研究提供了一个基础，以促进对酶法转化CO 2 的进一步探索。
图7 甲酸到甲醇的转化与原位NADH 辅因子的再生
由于游离酶稳定性较差，需要对多酶系统进行固定化，以实现其持续和重复使用性。WANG 等 构建了一个微胶囊内腔，包含固定化甲酸脱氢酶（FDH，E1）、共价键合的甲醛脱氢酶（FaldDH，E2）和固定化醇脱氢酶（ADH，E3）。通过微细胞工厂级联反应实现了CO 2 在温和条件下转化为甲醇（见 图8 ）。XU 等 通过将3 种脱氢酶包裹在新鲜的海藻酸盐-二氧化硅(ALG-SiO 2 )复合材料中，在自然 pH、低温和低压下，将 CO 2 生物转化为甲醇。
图8 微细胞工厂级联反应将CO
EL-ZAHAB 等 对酶-辅因子固定化系统进行了研究，通过辅因子原位再生将CO 2 转化为甲醇。将甲酸脱氢酶、甲醛脱氢酶、醇脱氢酶和谷氨酸脱氢酶（GDH）4 种酶和辅因子共固定化，反应30 min后，甲醇产率为0.02 mmol/(L∙h)。REN 等 将碳酸酐酶（CA）、FDH、辅因子（NADH）和GDH 包埋在ZIF-8 分子筛中，构建了一个纳米级的多酶反应器。与游离多酶体系相比，该体系有更强的CO 2 转化能力，甲酸盐产量比游离酶提高了4.6 倍。SINGH等 在多酶级联反应中，通过磷酸盐脱氢酶实现NADH 的再生，甲醇产量为7.9 mmol/L。BACCOUR等 利用来源于 Methylobacterium extorquens 的甲酸脱氢酶 Me FDH 和磷酸盐脱氢酶的突变体，构建了1 个流通式双酶反应器，在自然条件下利用CO 2 生产甲酸盐，产率达到1.7 g/(L·h)。
尽管科研工作者做了大量工作，也取得一些进展，但目前以CO 2 为底物还原制备甲酸盐的产率不高，生产规模在mmol/L 水平。这主要归因于CO 2 本身非常稳定，跨越其稳态需要克服较高的能量壁垒。在今后研究中，充分发挥光电催化的优势，将酶催化与光电催化紧密结合，有望取得更好的CO 2 还原效率。
6 结束语与展望
大气及工业产生的CO 2 提供了大量的碳源，为捕捉CO 2 而开发的技术促进了“碳达峰、碳中和”目标的实现，也是缓解全球变暖，以可持续经济取代化石经济所必需的。以CO 2 为原料的生物转化法是第三代生物制造路线，可有效降低生物制造业的成本，降低对化石资源的过分依赖，引起人们的高度重视 [59-60] 。通过生物催化途径来固定还原大气中的CO 2 极具吸引力和前景。然而，由于CO 2 本身十分稳定，催化它的还原需要较高的活化能以克服其能量壁垒。
围绕促进CO 2 固定还原的目标，本文重点讨论了甲酸脱氢酶的分类及催化机制、酶分子改造及在CO 2 固定还原中的应用情况，并提出未来发展方向：（1）通过对FDH 的分类及催化机制相关研究发现，金属辅因子依赖型FDH 具有更高的CO 2 还原活性，其催化活性较非金属辅因子依赖型FDH 高出4～5 个数量级，这为将来挖掘新型CO 2 还原用FDH 指明了方向。若要获得高CO 2 还原活性的FDH，应该以金属辅因子依赖型FDH 为主要研究对象。（2）通过对FDH 分子改造相关研究发现，尽管科研工作者做了大量研究工作，但在其辅酶选择性、稳定性及还原活性方面仍有较大的提升空间。在今后研究中，可基于大数据分析，充分利用人工智能方法，进一步提高FDH 三维结构的可及性及可信度，为FDH 的辅酶选择性、稳定性和催化活性的理性改造提供坚实的基础。（3）通过对FDH 在CO 2 固定还原中应用研究发现，单纯依靠FDH 本身的酶催化，CO 2 固定还原效率较低，难以实现工业化生产。今后工作中，可以充分发挥光电催化的优势，将酶催化与光电催化紧密结合，取长补短，有望取得更好的CO 2 固定还原效率。
