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QQ Ⅰ型胶原蛋白由3 条肽链右手螺旋而成，是细胞外基质的主要成分，大量存在于动物体的结缔组织中，具有良好的生物活性[1-3]。以胶原蛋白为基质或主要构件的海绵、凝胶、人造角膜、皮肤替代物、3D 生物打印和药物缓释材料等，具有其他替代材料无可比拟的优越性[4-6]，同时胶原蛋白还具有良好的生物降解性与生物相容性[7-12]。随着人们对胶原蛋白利用的日趋广泛，各行业对胶原蛋白的需求量和物性要求逐渐变高。通常，胶原蛋白原料是以固体海绵形式来储存的，但是，固体海绵并不是胶原蛋白应用的主要形式，胶原蛋白粉末或者溶液才是胶原蛋白作为添加剂或者对胶原蛋白进行溶液加工的初始原料[13-14]。然而，胶原蛋白难溶于水，易溶于稀酸，但在酸性溶液中，胶原蛋白分子会慢慢降解；而把酸性胶原蛋白溶液透析成中性，这种中性胶原蛋白分散体的制备过程不仅繁琐，同时降低了体系的热稳定性[1,15]。
近年来，随着胶原蛋白的应用范围不断拓展，各应用领域对胶原蛋白的物性要求，特别是溶解性要求进一步提升。在大部分应用领域，都要求制备得到的胶原蛋白样品具有良好的易溶性和速溶性，以提高操作的便捷性。但是，由于天然胶原蛋白的高分子构造，使其在常规溶剂中往往存在难溶或溶解时间长的特性。在天然材料如胶原蛋白领域，机械力，如：剪切力、离心力、超声、超高压、研磨等，常被用于对胶原蛋白的改性处理或者调控其体外组装过程[16-18]。其中，研磨还可以作为提高胶原蛋白溶解性的有效手段，它是利用机械能来诱发化学反应或引发材料组织、结构和性能变化，并以此来制备新材料的方法[19-20]。但是，常规的研磨粉碎方法，在粉碎过程中不可避免地使样品升温，从而极容易导致胶原蛋白的热变性，使其失去天然活性[18]。
为避免胶原蛋白在加工过程中的这种变化，本文首次将其预先冷冻再研磨（简称冷冻研磨）用于粉碎和调控材料性能。因此，将冷冻研磨技术直接应用于天然牛跟腱胶原蛋白粉碎，通过调节冷冻时间后再研磨制备胶原蛋白粉末。运用凝胶电泳（SDS-PAGE）、圆二色谱（CD）及红外光谱等方法对上述胶原蛋白粉末进行结构研究；在此基础上，研究冷冻研磨对样品的水溶性、热稳定性、黏度和细胞增殖能力的调节作用，为胶原蛋白在伤口愈合敷料、药妆、再生医学和临床医用材料等方面的应用提供理论支持[21-22]。
1 实验部分
1.1 试剂与仪器
牛跟腱胶原蛋白，河北考力森生物科技有限公司；冰乙酸、甲醇、十二水磷酸氢二钠、二水磷酸氢二钠，AR，国药集团化学试剂有限公司；胶原蛋白标品（Marker），赛默飞世尔科技（中国）有限公司；磷酸盐缓冲（PBS）溶液，吉诺生物技术有限公司；过硫酸铵、丙烯酰胺、1.5 mol/L Tris-HCl、考马斯亮蓝R-250 的四甲基二乙胺（TEMED）溶液（浓度1.9 mol/L）、SDS 蛋白上样缓冲液〔7.5%（体积分数）分离胶和4%（体积分数）浓缩胶（分离胶和浓缩胶均为混合物，包含水、质量分数30%丙烯酰胺溶液、1.5 mol/L Tris-HCl、质量分数10% SDS、质量分数10%过硫酸铵）〕，武汉博士德生物工程有限公司；DMEM 培养基（含质量分数10%胎牛血清的高糖培养基）、MTT（M8180）试剂盒，北京索莱宝科技有限公司；青霉素-链霉素混合液，南京赛博生物科技有限公司。
LGJ-10D 冷冻干燥机，北京四环科学仪器厂；MM400 冷冻混合球磨仪，弗尔德（上海）仪器设备有限公司；GHP-9050 隔水式培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；DYCZ-25D 双垂直电泳仪，北京六一仪器厂；Tanon-4100 凝胶成像系统，上海市天能科技有限公司；J-810 圆二色谱仪，日本JASCO 公司；NEXUS 傅里叶变换红外光谱仪，美国 Thermo Nicolet 公司；S-3000N 扫描电子显微镜，日本Hitachi公司；AFM MultiMode8 原子力显微镜，德国Bruker公司；DHR-1 旋转流变仪、DSC Q2000 差示扫描量热仪，美国TA 公司；DR-200Bs 酶标检测仪，山东博科科学仪器有限公司。
1.2 牛跟腱胶原蛋白样品的制备
先将牛跟腱胶原蛋白在液氮中预冻，预冻时间分别为3、6、12 和24 h，依次命名为COL3h、COL6h、COL12h、COL24h。然后运用冷冻混合球磨仪依次研磨，研磨条件：频率25 Hz，研磨时间均为5 min，装载量为800 mg。
对照样品1：天然、未经冷冻研磨处理的牛跟腱胶原蛋白命名为COL。对照样品2：天然牛跟腱胶原蛋白经液氮冷冻24 h，不使用研磨处理命名为FCOL。
1.3 结构表征
1.3.1 凝胶电泳
参考文献[23-24]方法进行SDS-PAGE 实验。体积分数7.5%分离胶10 mL、体积分数4%浓缩胶6 mL、胶原蛋白标品进样量10 μL、样品加样量15 μL；结束电泳后用脱色液（体积分数7.5%冰乙酸和体积分数5%甲醇）浸泡至样品出现清晰条带，使用凝胶电泳成像系统拍照分析。
1.3.2 红外光谱分析
利用傅里叶变换红外光谱仪检测冷冻研磨牛跟腱胶原蛋白结构的变化。取样品粉末压片，扫描波数范围4000～400 cm–1，扫描分辨率4 cm–1，扫描16 次。
1.3.3 CD 测试
采用CD 仪观察冷冻研磨后牛跟腱胶原蛋白分子三螺旋构象的变化。用冰乙酸溶解牛跟腱胶原蛋白样品后透析72 h（透析条件：在4 ℃、pH=7.4的PBS 缓冲液中透析72 h，间隔3～4 h 更换透析液，透析袋截留分子量14000），将透析完全的样品用PBS 稀释成质量浓度0.1 g/L 的溶液，然后进行CD扫描测试。扫描温度15 ℃，波长范围190～250 nm，扫描速率50 nm/min，扫描精度0.5 nm。
1.4 样品性能测试
1.4.1 原子力显微镜（AFM）测试
称取适量冷冻研磨牛跟腱胶原蛋白样品用0.5 mol/L 冰乙酸溶液溶解后透析（透析条件同1.3.3节），配制成质量浓度0.02 g/L 溶液。取5 μL 滴在云母片中间平铺一薄层至自然干燥2 h。将所有滴有样品的云母片放置于隔水式恒温培养箱（36 ℃）内培养24 h。使用原子力显微镜观察胶原蛋白纤维形貌。
1.4.2 扫描电子显微镜（SEM）测试
通过SEM 观察胶原蛋白样品组装后的纤维表面形态及粒径。取胶原蛋白样品5 mL 至离心管内，36 ℃（胶原蛋白组装温度）下放置于隔水式恒温箱内孵育12 h，胶原蛋白溶液组装为凝胶纤维，离心（离心力10000 g）后除去上清液，沉淀部分（组装后的纤维）用去离子水1～2 mL 洗2～3 次再次离心，获得的组装纤维用于测试纤维形态及粒径。纤维粒径的测量与统计：借助Nano measurer 软件测量SEM图中各胶原蛋白纤维粒径。每个样品选取不同区域的5 张图，统计100 根纤维直径数据，得到纤维粒径分布柱状图，计算平均粒径和标准偏差。
1.4.3 溶解度实验
在4 ℃下，称取研磨样品（质量记为m1，mg）加入10 mL 去离子水（pH=7）并搅拌12 h。将获得的分散体在6000 r/min 下离心5 min，以分离未溶解的胶原蛋白，80～90 ℃干燥6 h 后称量胶原蛋白质量（记为m2，mg）。胶原蛋白的溶解度由公式（1）计算得到。
1.4.4 热稳定性（DSC）分析
准确称取10 mg 研磨牛跟腱胶原蛋白样品，加入400 μL 0.5 mol/L 乙酸溶液充分溶胀（4 ℃，2 d）至样品呈均一透明状[19]，使用差示扫描量热仪检测冷冻研磨牛跟腱胶原蛋白样品的热变性温度以及热变焓值差异。测定条件为：空铝盒为空白对照，升温速率为5 ℃/min，扫描温度范围为20～60 ℃，氮气流量20 mL/min。
1.4.5 黏度测试
使用旋转流变仪对研磨牛跟腱胶原蛋白进行黏度测试，选择平行板夹具，夹具直径大小为40.0 mm，测试间隙为0.6 mm。测试频率为1 Hz，剪切速率在3 min 内从0.1 s–1 升到1000 s–1，实验温度为10 ℃（以避免样品自组装）。每个样品重复3 次取平均值。
1.4.6 促细胞增殖性能测试
将胶原蛋白样品用0.5 mol/L 乙酸溶解成2 g/L胶原蛋白乙酸溶液，透析（同1.3.3 节透析方法）至中性。样品中加入质量分数为3%的双抗（青霉素和链霉素，质量比为1∶1）溶液，配制浓度为1×105个/mL 的细胞悬液（小鼠的成纤维细胞NIH/3T3），按3000～5000 个细胞/每孔接种于96 孔板中，每孔加100 μL 双抗溶液，将上述96 孔板置于CO2（5%，体积分数）培养箱中（37 ℃）培养24 h 以贴壁。继续培养24 h 后分别加入200 μL DMEM 培养基与200 μL 胶原蛋白样品。每个样本设9 个重复，按实验设计培养一定时间。分别取培养1、3 和5 d 后的样品，向所有孔中加入20 μL MTT 溶液，培养箱中孵育 1～4 h。吸除上清液，每孔加二甲基亚砜（DMSO）200 μL，摇床摇匀，使用酶标仪测定490 nm 处吸光度，吸光度越高意味着促细胞增殖能力越好。
2 结果与讨论
2.1 SDS-PAGE 分析
通过 SDS-PAGE 研究了冷冻和冷冻研磨处理对胶原蛋白分子结构的影响，如图1 所示。
图1 不同预冻时间牛跟腱胶原蛋白样品的SDS-PAGE谱图
Fig.1 SDS-PAGE spectrum of bovine achilles tendon collagen samples with different pre-freezing time
0—标准品；1—COL；2—FCOL；3—COL3h；4—COL6h；5—COL12h；6—COL24h
所有泳道显示清晰的α1、α2 和β 条带，这是典型的Ⅰ型胶原蛋白电泳图[25]。整体而言，冷冻研磨后样品与对照COL 无显著性差异，说明冷冻研磨不会对胶原蛋白的立体结构产生严重的破坏作用。对比不同预冻时间可以发现，液氮冷冻3 和6 h 样品即3 号、4 号泳道，在100 kDa 下方均出现了少量颜色较浅的降解带，这可能是因为预冻时间短，研磨过程可能会局部过热，导致少部分胶原蛋白肽链结构受到影响，极少部分肽链断裂为小分子片段或者三螺旋结构解旋；而5 号（预冻12 h）和6 号（预冻24 h）泳道下方则基本无小分子条带，这说明预冻足够的时间后再研磨，并不会影响胶原蛋白分子间的相互作用力，样品的肽链结构保持不变。这可能是因为冷冻时间足够长可以更好地分散研磨产生的热量，因此不会对胶原蛋白的肽链结构造成影响。
2.2 红外光谱分析
图2 是不同冷冻时间处理的牛跟腱胶原蛋白样品的红外谱图。图中各样品均出现了Ⅰ型胶原蛋白典型的酰胺A、B 带以及Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ带的吸收峰[26]。天然胶原蛋白COL 的酰胺Ⅱ带（1544.47 cm–1）波数均比研磨胶原蛋白样品COL3h（1539.6 cm–1）、COL6h（1538.60 cm–1）、COL12h（1538.13 cm–1）、COL24h（1538.00 cm–1）高，而胶原蛋白中酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ带与胶原蛋白的多肽链结构构型及有序程度有关[26]。对比FCOL 发现，冷冻时间对酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ带的值几乎无影响。因此，冷冻时间对胶原蛋白的天然结构几乎无影响，这与前面SDS-PAGE 结果一致。样品COL3h、COL6h、COL12h 和COL24h仅酰胺A 带发生红移，红移主要原因推测来自于研磨，可能在机械力研磨作用下，胶原蛋白分子间的氢键作用发生改变，导致极少部分三螺旋解旋或者是肽链结构被破坏，使胶原蛋白蛋白多肽链的有序性发生一定变化。
图2 天然牛跟腱胶原蛋白与研磨处理后的胶原蛋白样品的红外谱图
Fig.2 FTIR spectra of natural bovine heparin collagen and ground collagen samples
2.3 CD 分析
胶原蛋白的所有应用都以保持胶原蛋白的三螺旋结构为前提。图3 是不同冷冻时间研磨的牛跟腱胶原蛋白的CD 谱图。从图3 可以观察到，各胶原蛋白样品均在198 nm 附近出现一个较强的负吸收峰，在223 nm 处存在一个较弱的正吸收峰，这是Ⅰ型胶原蛋白典型的三螺旋结构特征[27]。对比天然胶原蛋白的CD 图发现，不同预冻时间处理后的胶原蛋白样品负吸收峰最低值和正吸收峰最高值并没有呈现规律性变化，说明冷冻研磨后胶原蛋白的立体构造未发生显著改变，胶原蛋白的三螺旋结构也并未受到严重破坏，各样品的具体结构变化需进一步计算rpn 值（胶原蛋白CD 谱中正吸收峰和负吸收峰强度比值的绝对值[28]）。
图3 不同预冻时间处理的胶原蛋白样品的CD 谱图
Fig.3 CD spectra of collagen samples treated at different pre-freezing time
通过rpn 值可以有效地判断胶原蛋白是否具有完整的三螺旋构象[29-30]。研究表明，当rpn 值范围在0.12～0.15 之间时，胶原蛋白具有完整的三螺旋构象。不同预冻时间研磨处理的胶原蛋白样品rpn 值见表1。
表1 不同预冻时间研磨处理的胶原蛋白样品的rpn 值
Table 1 rpn Values of collagen samples ground at different pre-freezing time
样品名称 平均rpn 值 误差COL 0.132 ±0.023 FCOL 0.127 ±0.009 COL3h 0.110 ±0.007 COL6h 0.105 ±0.008 COL12h 0.116 ±0.011 COL24h 0.123 ±0.007
由表1 可知，COL 的rpn 值为0.132，FCOL 的rpn 值为0.127，说明天然胶原蛋白与单纯冷冻的胶原蛋白在结构上均保持了完整的三螺旋构象，进一步印证了单纯冷冻对天然胶原蛋白结构无影响。COL3h、COL6h 和COL12h 的rpn 值分别是0.110、0.105 和0.116，三螺旋结构含量与对照样品COL 和FCOL 相比略有减少，说明短时间冷冻再研磨对三螺旋结构不利，可能会有少量三螺旋结构解旋或者肽链断裂，这与SDS-PAGE 的实验结论互相吻合。COL24h 的rpn 值是0.123，与对照样品更为接近，结合SDS-PAGE 实验说明，冷冻24 h 再研磨5 min对样品三螺旋结构的影响可以降到最低。
2.4 组装纤维AFM 分析
胶原蛋白具有独特的自组装成纤维的性质。为研究冷冻研磨对胶原蛋白自组装成纤维的影响，采用AFM 分析胶原蛋白组装纤维的形貌，结果见图4。由图4 可见，对照样品COL 和FCOL 中可观察到清晰的胶原蛋白纤维，且每根胶原蛋白纤维出现了明暗相间条纹（Ⅰ型胶原蛋白所特有结构：D 周期）[31]，进一步说明单纯冷冻预处理对胶原蛋白体外自组装能力无影响。样品 COL3h、COL6h、COL12h 和COL24h 无法观察到D 周期，但是胶原蛋白的组装纤维很明显，表明天然牛跟腱胶原蛋白冷冻研磨5 min 后都保持了胶原蛋白的完整三螺旋结构。无法观察到明显的D 周期可能是因为胶原蛋白经冷冻研磨处理后的组装纤维直径较天然胶原蛋白小，猜测是因为冷冻研磨改变了胶原蛋白大分子间相互作用的氢键数量[32]，从而使胶原蛋白纤维组装粒径变小，但并不影响胶原蛋白组装成纤维，也不影响天然胶原蛋白的自组装能力。
图4 研磨牛跟腱胶原蛋白样品的AFM 图
Fig.4 AFM images of ground achilles tendon collagen samples
2.5 组装纤维的SEM 分析
为进一步验证研磨胶原蛋白自组装后粒径变化情况，对COL、FCOL 和COL24h 3 个样品进行了SEM 分析，所有样品均在同一放大倍数下观察，结果见图5。由图5 可见，样品COL24h 的平均直径〔（77.6±17.9） nm〕比样品COL〔平均直径（96.0±24.8） nm〕和FCOL〔平均直径（82.1± 19.8）nm〕的纤维直径略小。但经平均粒径数据计算发现，COL、FCOL 和COL24h 3 个样品的纤维粒径并无显著性差异。天然胶原蛋白体外自组装纤维的大小及空间分布状态与胶原蛋白种类、环境pH、温度、离子强度等有着紧密关系。天然胶原蛋白分子具有稳定的三螺旋结构，研磨的机械力可能对分子间的相互作用力产生了一定的影响，但并未严重破坏胶原蛋白分子的三螺旋结构，其仍具有体外组装能力。因此，组装纤维的粒径并无显著性差异。结合SDS-PAGE 和CD 分析，预冻24 h 再研磨5 min 对胶原蛋白的天然三螺旋结构的影响最小，几乎可以忽略。
图5 牛跟腱胶原蛋白样品纤维形貌及对应纤维粒分布
Fig.5 Morphology and corresponding fiber particle distribution of bovine achilles tendon collagen samples
上角标字母a 是显著性差异标识，字母相同代表无显著性差异
2.6 溶解度
天然牛跟腱胶原蛋白呈一种干燥多孔的海绵状态，经过冷冻研磨处理后成为粉末状。为了进一步研究冷冻研磨对胶原蛋白水溶性的影响，采用称重法测试研磨胶原蛋白样品在水中的溶解度，结果见图6。
图6 研磨牛跟腱胶原蛋白样品的溶解度
Fig.6 Solubility of ground bovine achilles tendon collagen samples
图中不同字母代表有显著性差异，相同字母代表无显著性差异
由图6 可知，COL 在纯水中的溶解度为0.29 g/L，低于其临界聚集浓度（0.50 g/L）[33]。样品FCOL 的溶解度与COL 无显著性差异，说明仅仅是预冻对胶原蛋白的水溶性影响不大。但是对照样品与冷冻后再研磨的样品在溶解度上存在显著性差异。随着冷冻时间从3 h 增加到24 h，样品的溶解度从0.58 g/L（COL3h）升至1.03 g/L（COL24h）；与COL 相比，COL24h 在纯水中的溶解度提高了近3 倍，由此可见，胶原蛋白的溶解度随预冻时间延长而增大。这可能是预冻后再研磨改变了胶原蛋白分子间相互作用力，致使胶原蛋白分子中的亲水基团（如—COOH、—OH）更多暴露出来，使分子亲水性增加。对于COL24h，溶解度虽然超过了临界聚集浓度，但原纤维生成能力减弱，COL24h 在37℃下仍能组装，只是纤维粒径略变小（参见2.5 节组装纤维的SEM 分析）。尽管如此，改善胶原蛋白的水溶性仍然具有重要的作用，例如更方便取用和更好的加工性能。当用于化妆品、保健品和功能性添加剂时，COL24h 甚至可以少量直接添加，从而避免了酸溶解和随后透析制备胶原蛋白溶液的繁琐操作[19-20]。
2.7 热稳定性分析
天然胶原蛋白在热变性后会成为明胶甚至变成相对分子质量更小的水解胶原蛋白[34]。此时胶原蛋白的低抗原性、生物相容性等优良特性都将改变，因而胶原蛋白的制备、储存和应用都必须防范胶原蛋白热变性过程的发生，以确保胶原蛋白的三螺旋结构与生物学性能不发生改变。
采用差示扫描量热法检测胶原蛋白的热变性温度，结果见图7。由图7 可知，COL 的热变性温度（Td）为39.97 ℃，FCOL 的热变性温度为39.31 ℃，且所有样品的热变性温度均在39 ℃以上，温度相差不大，说明冷冻研磨并未对胶原蛋白的三螺旋结构造成严重破坏。COL 的热变性焓值（ΔH）为0.97 J/g，FCOL 的热变性焓值略有下降，为0.55 J/g。研磨5 min 后的样品COL3h、COL6h、COL12h、COL24h 热变性焓值均比未研磨的两个对照样品低，但随着冷冻时间的延长，热变性焓值逐渐增加，COL24h 热变性焓值最大，为0.28 J/g。样品的热变性焓值减小意味着样品解开三螺旋结构所需的热能减少，这表明短时间冷冻再研磨会改变胶原蛋白分子间的相互作用模式[35]，冷冻时间越短，研磨造成的影响越大，因此选择以冷冻24 h 为佳。虽然冷冻24 h 后COL24h 热变性温度及焓值仍然低于对照样品，但这一问题可以通过胶原蛋白的交联来提高其稳定性[22]，使其更适合用于医用生物支架材料[36]。
图7 牛跟腱胶原蛋白样品的DSC 曲线
Fig.7 DSC curves of bovine achilles tendon collagen samples
2.8 黏度分析
牛跟腱胶原蛋白样品的表观黏度与剪切速率关系见图8。由图8 可知，所有样品均表现出胶原蛋白溶液典型的“剪切变稀”现象。胶原蛋白分子中的三股螺旋结构之间的作用力主要依赖于氢键等非共价键，所有胶原蛋白样品随着剪切速率增大，表观黏度都表现出急剧下降的趋势。图8 中COL 与FCOL 表观黏度随着剪切速率增加而减小，在剪切速率小于200 s–1 时表观黏度下降迅速，大于200 s–1之后下降趋势趋于平缓，二者的变化趋势基本一致。冷冻研磨5 min 后的样品（COL24h）与对照（COL）相比，表观黏度减小比较明显，但COL3h、COL6h、COL12h 及COL24h 之间的表观黏度差异并不大，且随着剪切速率的增加表观黏度下降趋势一致，这表明当预冻时间不同时，胶原蛋白的三股螺旋结构是否完整主要受研磨机械力影响，研磨会使分子间氢键数量发生改变，分子间其他非共价键的结合程度也受到影响，导致分子间作用力变弱，因此表现出“剪切变稀”现象[1]。与对照样品相比，研磨后的胶原蛋白具有更优良的流动性。
图8 胶原蛋白样品的表观黏度与剪切速率的关系
Fig.8 Relationship between apparent viscosity and shear rate of collagen samples
2.9 促细胞增殖性能分析
通过前面一系列实验发现，冷冻24 h 后研磨5 min 样品COL24h 的天然三螺旋结构保持较完整且溶解度较COL 提高近3 倍。因此，为进一步研究冷冻研磨对胶原蛋白生物学性能的调控，将COL、FCOL 和COL24h 3 个样品培养小鼠的成纤维细胞NIH/3T3，将培养1、3 以及5 d 后的细胞取出观察生长状态，结果如图9 所示。由图9 可知，培养1 d后取出细胞进行观察发现，COL、FCOL 和COL24h均可以促进NIH/3T3 生长，且COL24h 样品促生长能力略高于前两者；当培养时间为3 d 时，各样品对于NIH/3T3 细胞生长仍表现为促生长作用，且相比培养时间为1 d 时更为明显；培养时间达到5 d 时，样品COL 的促生长作用减缓，相对而言，样品FCOL及COL24h 对NIH/3T3 的促生长作用更明显，并且在培养的过程中，这两组样品的促生长作用保持快速增加的趋势。相比对照COL，COL24h 更利于细胞生长。胶原蛋白的三螺旋结构是其发挥生物功能的基础。胶原蛋白能够提供细胞结合的位点，从而有利于细胞的贴壁和繁殖。经冷冻研磨处理后的胶原蛋白改变了分子间的相互作用力，可能暴露出更多的结合位点，更利于细胞生长和繁殖。
图9 NIH/3T3 在样品中培养1～5 d 的活性
Fig.9 Activity of NIH/3T3 after 1～5 d incubation in samples
*代表P<0.05；***代表P<0.001；****代表P<0.0001
3 结论
运用冷冻研磨技术，通过改变预冻时间对天然牛跟腱胶原蛋白海绵进行粉碎处理，以期实现研磨产物的性能调控。SDS-PAGE 和CD 实验结果发现，冷冻时间分别为3、6 h 时，有少量小分子条带，而冷冻24 h 后胶原蛋白的肽链结构保持得更完整。AFM 和SEM 实验证明，冷冻研磨得到的胶原蛋白保持体外自组装能力，COL24h 组装得到的胶原蛋白纤维直径与COL 无显著性差异。溶解度实验表明，冷冻研磨可以显著提高胶原蛋白的水溶性（4 ℃），COL24h 比未经任何处理的天然胶原蛋白（COL）的溶解度提高近3 倍，这将对胶原蛋白作为医美材料的应用有更好的支撑作用。细胞生物学实验揭示，相比于天然胶原蛋白，研磨后的胶原蛋白材料对细胞的促生长作用提高，冷冻研磨得到的胶原蛋白粉末材料将拓宽胶原蛋白在创伤修复领域的影响。
