酶-化学级联催化制备(S)-烟碱
《精细化工》
2024年 41卷
第1期
20230172
中图分类号：TQ203.2
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摘要
传统(S)-烟碱合成方法步骤复杂且依赖多种化学催化剂。为了实现(S)-烟碱的绿色合成，设计了酶-化学级联途径：首先，构建了亚胺还原酶（IRED）与甲酸脱氢酶（FDH）的偶联体系，以麦斯明为底物合成(S)-降烟碱；然后，将(S)-降烟碱经Eschweiler-Clarke反应制备(S)-烟碱。通过大肠杆菌宿主分别对IRED和FDH进行表达，得到含酶细胞及酶液，考察了pH和温度对细胞中IRED和FDH酶活力的影响。优化酶催化制备(S)-降烟碱的反应条件，在30 ℃、pH 7.5条件下，添加质量浓度为30 g/L的麦斯明、600 U/L FDH细胞、900 U/L IRED细胞、0.6 mmol/L NADP和质量浓度为90 g/L的甲酸钠，(S)-降烟碱的产率>98%，对映体过量（e.e.）值>99%。最后，通过化学法将(S)-降烟碱甲基化得到(S)-烟碱，此步骤产率和e.e.值均达99%以上。
关键词: (S)-烟碱 亚胺还原酶 甲酸脱氢酶 ( S)-降烟碱 生物工程
烟碱（1-甲基-2-[3-吡啶基]吡咯烷）又名尼古丁，是一种可以从烟草植物叶子中获得的天然物质，被广泛应用于农业、医药以及烟草等领域。特别是( S )-构型的烟碱可直接用于治疗皮肤病、心血管病、蛇虫咬伤等 。贺桂泉 研究表明，烟碱可通过刺激烟碱受体释放乙酰胆碱，提高阿尔兹海默症患者的神经传递能力，从而改善阿尔兹海默症患者的认知功能。市场上色谱纯的烟碱（HPLC纯度>98.5%）每吨售价近百万元人民币，以烟碱为有效成分的药物销售额也在逐年增长。国内生产的烟碱大多纯度较低，因此，制备高纯度( S )-烟碱具有巨大应用价值 。
目前，可通过烟草植物叶提取的方法获得( S )-烟碱，但此法杂质多、纯度低、受地理环境因素影响大，并存在杂质难分离的问题 。此外，( S )-烟碱也可由化学合成的方法获得，即由底物麦斯明通过化学方法制备降烟碱，再通过甲基化得到( R )-烟碱和( S )-烟碱的外消旋混合物，再将其进行拆分，从而获得( S )-烟碱 。此法相对提取法可以获得纯度较高的产品，并能进行工业化生产，但步骤繁杂，对环境危害较大（ 图1 a）。
图1 (
生物催化法具有高度的立体选择性，且具备反应条件温和、对环境友好等优点。将酶催化取代部分化学催化，构建酶-化学级联催化体系制备( S )-烟碱是非常有意义的思路（ 图1 b），其原料易得、成本低廉且具有步骤简洁、环保高效的优势，具有良好的工业应用前景和经济效益 。
亚胺还原酶（IRED）依赖还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH），在手性胺的合成方面有重要的应用潜力 [9-10] 。NADPH会随着产物的生成而消耗，且价格昂贵，限制了IRED的大规模生产应用。可通过在反应系统中加入另一种再生酶，构建一个高效、低成本的辅酶再生体系，实现NADPH的再生 。目前，葡萄糖脱氢酶（GDH）被广泛应用于NADPH再生，其催化葡萄糖生成葡萄糖酸的同时将氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP + ）还原为NADPH [12-14] 。虽然GDH是构建NADPH再生体系常用的氧化还原酶，但在实际生产过程中，其产生的葡萄糖酸不仅使反应pH下降，还增加了目标产物的分离难度。例如：在应用亮氨酸脱氢酶（LeuDH）生产L-叔亮氨酸的工艺中，虽然LeuDH偶联GDH体系反应的产率比偶联甲酸脱氢酶（FDH）体系高20%，但其产物分离、纯化较困难，生产成本反而更高 [15-16] 。相比而言，FDH可催化甲酸盐再生NADPH，同时产生气体CO 2 ，既能简化目标产物的后期分离步骤，又能降低生产成本 [17-18] 。目前，在自然界中NADP + 依赖型FDH的数量仅占20%，这一缺点限制了其在工业生产中的应用。近年来，诸多文献报道了FDH的改造实例 [19-20] ，但并未将其投入实际应用。将研究中获得的催化活性更高、稳定性更强的FDH应用于工业生产，具有巨大潜力。
因此，为了更加绿色、高效地制备( S )-烟碱，本研究拟以NADP + /NADPH依赖型的IRED和FDH来构建IRED-FDH双酶体系催化麦斯明合成( S )-降烟碱，并对反应条件进行优化；最后，通过Eschweiler-Clarke甲基化反应得到高纯度( S )-烟碱（ 图2 ）。本文设计的酶-化学级联催化体系有望为( S )-烟碱的绿色生产提供理论参考，并具有良好的应用前景。
图2 酶-化学级联催化制备(
1 实验部分
1.1 试剂与仪器
酵母浸粉、胰蛋白胨，生化试剂，北京奥博星生物技术有限责任公司；甘油，分析纯，天津鼎国生物有限公司；卡那霉素，药用级，北京索莱宝科技有限公司；异丙基- β -硫代半乳糖苷（IPTG），药用级，日本Takara公司；NADPH（质量分数95%）、NADP + （质量分数97%）、麦斯明（质量分数98%）、磷酸盐（PBS）缓冲液（100 mmol/L，pH 7.0）、PBS缓冲液（1 mol/L，pH 6.5）、甲酸钠（分析纯）、葡萄糖（分析纯），阿拉丁科技（上海）股份有限公司；多聚甲醛、甲酸、甲基叔丁基醚，分析纯，北京迈瑞达科技有限公司；碳酸钠、氢氧化钠、无水硫酸钠、氯化钠，分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司。
UV-1100型紫外-可见分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司；5910-Ri型高速冷冻离心机，德国艾本德公司；DYY-6C型电泳仪，北京市六一仪器厂；Tanon 1600型凝胶成像系统，上海天能科技有限公司；BILON-250Y型高压匀质机，上海顾信生物科技有限公司；LRH-1000F型生化培养箱，上海恒一科学仪器有限公司；LC-20A型高效液相色谱仪，岛津实验器材有限公司；ZWY-2000型恒温培养振荡器、ZHJH-C1118B型超净工作台，上海智诚分析仪器有限公司。
菌株和质粒：表达载体为pET-28a(+)，表达宿主菌为 E. coli BL21(DE3)，金唯智生物科技有限公司。
培养基：LB培养基包括质量分数0.5%酵母浸粉、质量分数1.0%胰蛋白胨、质量分数1.0%氯化钠和质量分数1.5%琼脂（固体培养基添加）；TB培养基包括质量分数2.4%酵母浸粉、质量分数1.2%胰蛋白胨、质量分数0.4%甘油、质量分数10.0% PBS缓冲液（1 mol/L，pH 6.5）。培养基于121 ℃灭菌20 min，添加卡那霉素至终质量浓度为50 mg/L。
1.2 方法
1.2.1 重组菌株的构建
由NCBI基因库中得到具有麦斯明底物活性的IRED基因序列（Genbank: WP_074958336.1） ，并对其进行密码子优化，将IRED基因克隆至表达载体pET-28a(+)的酶切位点 Nde Ⅰ和 EcoR Ⅰ之间，构建重组表达质粒pET-28a(+)-IRED。将构建的重组质粒pET-28a(+)-IRED转化到 E. coli BL21(DE3)感受态细胞中，涂布于含有卡那霉素的抗性平板培养过夜，挑选单菌落经聚合酶链反应（PCR）验证获得阳性菌株。基因合成委托金唯智生物科技有限公司完成。
选择 Pseudomonas sp. 101来源的经突变后的FDH 。同样地，以 E. coli BL21(DE3)为宿主菌株，以pET-28a(+)为表达载体，酶切位点选取 Nco Ⅰ和 Xho Ⅰ。获得重组菌株的其他制备过程与上述一致。
1.2.2 目的基因的诱导表达及酶学性质的测定
挑取阳性菌株单菌落接种至10 mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中，37 ℃、180 r/min活化培养12~16 h。将活化后的菌液以体积分数1%的接种量接种至50 mL卡那霉素抗性的TB液体培养基中，37 ℃、180 r/min振荡培养，待菌液在600 nm下的吸光度（OD 600 ）为0.6~0.8时，加入终浓度为0.1 mmol/L的IPTG于20 ℃、180 r/min诱导表达18~20 h。将发酵后的菌液在4 ℃、8000 r/min下离心10 min收集菌体。所得菌体用PBS缓冲液（100 mmol/L，pH 7.0）洗涤两次，随后重悬菌体，并在高压匀质机中破碎，收集破碎液，于4 ℃、12000 r/min下离心15 min，取上清液即获得粗酶液，并用于十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测蛋白表达。
酶活力（1U）定义为：30 ℃下，pH 7.0条件下，每分钟还原（氧化）1 μmol NADPH（NADP + ）的酶量。
IRED的酶活力测定方法为：30 ℃下，在1 mL的反应体系中，含10 mmol/L底物麦斯明、0.1 mmol/L NADPH、100 mmol/L PBS缓冲液（pH 7.0）以及适量的IRED细胞 。通过紫外-可见分光光度计检测反应体系在340 nm处1 min内吸光度的变化量。
FDH的酶活力测定方法为：30 ℃下，在1 mL的反应体系中，含100 mmol/L底物甲酸钠、1 mmol/L NADP + 、100 mmol/L PBS缓冲液（pH 7.0）以及适量的FDH细胞 。通过紫外-可见分光光度计检测反应体系在340 nm处1 min内吸光度的变化量。
其中，比酶活力按照式（1）进行计算 ：
式中： K 为酶活力，U； m 为细胞湿重，g。
pH对细胞中IRED和FDH酶活力的影响：在30 ℃下，取5 g湿细胞，分别于不同pH（5.0~12.0）的缓冲液中孵育5 min，测定其在不同pH缓冲液中的相对酶活力，相对酶活力是以IRED和FDH在各自最适pH条件下的酶活力作为对照（100%）。为了测定细胞在不同pH条件下的稳定性，在30 ℃下，取适量细胞，分别于不同pH（IRED：6.0~10.0，FDH：5.0~9.0）的缓冲液中孵育一定时间，定时取样测其剩余酶活力，剩余酶活力以孵育0 h时的酶活力作为对照（100%）。
温度对细胞中IRED和FDH酶活力的影响：取5 g湿细胞，分别于不同温度（10~70 ℃）孵育5 min后，在最适pH下测定其在不同温度下的酶活力，并以IRED和FDH在各自最适温度下的酶活力作为对照（100%）。为了研究细胞在不同温度条件下的稳定性，将适量细胞，分别于不同温度（20~70 ℃）孵育一定时间，定时取样测其剩余酶活力，剩余酶活力以孵育0 h时的酶活力作为对照（100%）。
1.2.3 IRED-FDH催化体系的构建及反应条件的优化
将IRED细胞和FDH细胞与不同pH（6.0~11.0）的缓冲体系（200 mL）充分混合，将得到的反应混合物在20~70 ℃下反应14 h，以确定全细胞反应的最优pH和温度；接下来分别将细胞（200~700 U/L）以不同的活性添加比例（IRED与FDH的酶活力比值为0.75~2.00）在不同质量浓度的麦斯明（10~70 g/L）、不同浓度的NADP + （0.1~0.7 mmol/L）、不同质量浓度的甲酸钠（50~110 g/L）下合成( S )-降烟碱，以考察细胞添加量及添加比例、底物质量浓度、NADP + 浓度和甲酸钠质量浓度对反应的影响。筛选出最优反应条件，在最优条件下反应14 h，检测产物的产率和对映体过量（e.e.）值。
1.2.4 化学法合成( S )-烟碱
将酶法催化得到的200 mL含( S )-降烟碱反应液于4 ℃、12000 r/min下离心10 min，取上清液并向其中加入40 mL多聚甲醛（0.3 mol/L）和40 mL甲酸（0.3 mol/L），之后将混合物逐渐升温加热至80℃反应约4 h。待液体冷却后，加入40 mL氢氧化钠溶液（0.4 mol/L）碱化，之后使用600 mL甲基叔丁基醚对反应液进行萃取，并用无水硫酸钠干燥，将萃取液进行蒸馏，得到( S )-烟碱 。由高效液相色谱仪测定其产率及e.e.值。
1.2.5 分析方法
( S )-降烟碱和( S )-烟碱均采用高效液相色谱仪分析。( S )-降烟碱分析条件 ：Chiralpak AD-H柱（250 mm×4.6 mm×5 μm），流动相为 V (正已烷)∶ V (乙醇)∶ V (二乙胺)=74.9∶25.0∶0.1混合液，检测波长254 nm，流速1 mL/min。( S )-烟碱分析条件 ：Chiracel OD-H柱（250 mm×4.6 mm×5 μm），流动相为 V (正己烷)∶ V (1-丁醇)∶ V (二乙胺)=94.9∶5.0∶0.1混合液，检测波长254 nm，流速1 mL/min。
产物的产率和e.e.值分别由式（2）和（3）进行计算：
式中： X 为产率，%； Y 为e.e . 值，%； c 1 为产物的实际产量，mol； c 2 为产物的理论产量，mol；[ S ]为样品中( S )构型产物的量，mol；[ R ]为样品中( R )构型产物的量，mol。
2 结果与讨论
2.1 重组菌株的蛋白表达
将重组菌株单菌落活化14 h后，接种到TB培养基中，待OD 600 达到0.6~0.8时，加入IPTG诱导表达18~20 h。离心获得菌体，经高压匀质机破碎后，离心获得粗酶液。经SDS-PAGE检测蛋白表达情况，结果见 图3
图3 IRED和FDH粗酶液的SDS-PAGE蛋白电泳分析
由 图3 可知，IRED和FDH粗酶液中分别含有一条明显蛋白条带，相对分子质量大小分别约为38和45 kDa，与理论蛋白相对分子质量一致。由此可知，IRED和FDH在 E. coli BL21(DE3)中均成功表达。
2.2 pH和温度对细胞中IRED和FDH酶活力的影响
pH是影响酶活力的一个关键因素，不同pH对应的离子环境维持着基团的离子形式，极端的pH可导致酶分子活性中心的氨基酸解离，使酶的空间构象发生变化，影响酶活力 。按1.2.2节实验方法，考察了pH和温度对细胞中IRED酶活力的影响，结果见 图4 。由 图4 a可见，随着pH的增高，细胞中IRED的相对酶活力呈现先升高后降低的趋势，在pH为8.0时，相对酶活力达到最高。根据已有研究报道 [27-29] 可知，IRED的最适pH通常在6.0~8.0之间，本研究所使用的IRED最适pH为8.0。由 图4 c可知，随着孵育时间的增加，细胞中IRED的剩余酶活力逐渐降低，在pH 8.0的缓冲液中孵育8 h后，细胞中IRED的剩余酶活力为初始酶活力的76%，而在pH 10.0的缓冲液中孵育8 h后，剩余酶活力为42%；在pH 7.0~9.0的范围内孵育8 h后，剩余酶活力均在50%以上。结果证明，在此pH范围内，细胞中IRED有较好的稳定性，也说明其在弱碱性环境中具有良好的酶活力和稳定性。
图4 pH和温度对细胞中IRED酶活力的影响
温度对酶蛋白稳定性有着重要的影响，随着温度的升高，可能会导致维持酶蛋白空间构象的次级键断裂，导致酶失活 。由 图4 b可见，IRED最适温度为35 ℃。由于反应过程通常持续若干小时，因此，测定了细胞中IRED的热稳定性，结果如 图4 d所示。由 图4 d可见，孵育8 h后，IRED在20~40 ℃范围内的剩余酶活力为90%以上，随着温度的升高，细胞中IRED的剩余酶活力有所降低。一般而言，对与底物结合和参与反应的关键氨基酸残基进行突变可能会提升酶活力和热稳定性，ZHANG等 和SCHOBER等 通过改变关键残基位点提升了IRED的最适温度、pH稳定性和热稳定性，然而这方面的研究还需要进一步展开。
按1.2.2节实验方法，考察了pH和温度对细胞中FDH酶活力的影响，结果见 图5
图5 pH和温度对细胞中FDH酶活力的影响
pH对细胞中FDH相对酶活力的影响如 图5 a所示。由 图5 a可知，随着pH的增高，细胞中FDH的相对酶活力变化呈现同IRED相同的趋势，与之不同的是，在pH为6.0时，FDH相对酶活力达到最高。细胞中FDH的pH稳定性的测定结果如 图5 c所示。由 图5 c可知，随着孵育时间的增加，FDH的酶活力逐渐降低，在pH 6.0的缓冲液中孵育8 h后，FDH的剩余酶活力为96.3%，而在pH 9.0的缓冲液中孵育8 h后，剩余酶活力为78.0%，证明在此pH范围内，细胞中的FDH有很好的稳定性。
温度对细胞中FDH相对酶活力的影响如 图5 b所示。由 图5 b可知，FDH的最适温度为50 ℃。其热稳定性的测定结果如 图5 d所示。由 图5 d可知，孵育8 h后，在20~50 ℃范围内FDH的剩余酶活力均在80%以上，并且随着温度的升高，FDH的酶活力下降速度变快。酶活力的丧失通常与催化过程的化学修饰和热变性有关，FDH在高温下容易失活的主要原因是半胱氨酸残基存在易被氧化的巯基，程峰等 通过对比不同来源FDH中的半胱氨酸残基位点发现，来源于细菌的FDH半胱氨酸残基数量最多，其次为来源于植物的FDH，来源于酵母菌和真菌的FDH半胱氨酸残基数量略低于细菌和植物。不仅在高温下酶失活与半胱氨酸残基有关，大多数情况下，低于40 ℃时的变性也是由该残基的化学修饰或氧化引起的 。
2.3 反应条件对全细胞催化制备(
2.3.1 温度和pH对全细胞催化制备( S )-降烟碱的影响
温度和pH均会影响酶的活性，不同的酶在催化反应中往往有不同的最适温度和pH，但当两种酶处于同一反应体系中催化反应时，需要综合考虑温度和pH对两种酶的影响。细胞膜有保护胞内酶的作用，能抵御部分胞外环境的变化。在使用全细胞作催化剂时，除了要满足酶的温度和pH条件外，还要保证细胞完整，以防因细胞破碎而影响酶蛋白结构。因此，在最适温度和pH条件下保证全细胞的高效反应进行尤为重要。
在生物催化的反应中，过高的温度会导致酶的失活，反应温度过低时，反应速率又会降低。另一方面，在酶催化合成手性化合物过程中，温度有时会改变酶的立体选择性 。按1.2.3节实验方法和1.2.5节分析方法，考察了温度对全细胞催化反应的影响。在200 mL、pH 7.0的体系内包含质量浓度20 g/L麦斯明、质量浓度110 g/L甲酸钠、0.6 mmol/L NADP + 、700 U/L IRED细胞和700 U/L FDH细胞，于20~70 ℃下反应14 h，测定( S )-降烟碱的产率及e.e.值，结果如 图6 a所示。由 图6 a可知，当温度从20 ℃上升到30 ℃，反应速率加快，含酶细胞对麦斯明的催化效率提高，在30 ℃达到最高。但当温度高于30 ℃时，随着温度的持续升高，( S )-降烟碱的产率和e.e.值迅速下降。因此，全细胞催化麦斯明合成( S )-降烟碱反应的最佳温度为30 ℃。
图6 温度（a）和pH（b）对全细胞催化制备(
pH除了影响酶分子活性域相关基团或底物的解离，使得反应速度发生变化外，也影响催化过程中产物的对映选择性 。因此，按1.2.3节实验方法和1.2.5节分析方法，考察了pH对全细胞催化不对称还原反应的影响。在200 mL的体系内包含质量浓度20 g/L麦斯明、质量浓度110 g/L甲酸钠、0.6 mmol/L NADP + 、700 U/L IRED细胞和700 U/L FDH细胞，于6.0~11.0的pH梯度下，30 ℃反应14 h，测定( S )-降烟碱的产率及e.e.值。pH对全细胞催化不对称还原反应的影响如 图6 b所示。从 图6 b可以看出，随着pH从6.0增加到7.5，细胞催化的反应速率明显增加。在pH为7.5的反应体系中，产物的产率最高，当pH从7.5增加到11.0时，( S )-降烟碱的产率降低。推断由于过碱的条件使细胞中的酶变性失活。为了更准确的揭示原因，测定反应后细胞剩余酶活力，其中，剩余酶活力以初始pH 7.5时的酶活力作为对照（100%），结果见 图7 。由 图7 可知，pH>7.5时，FDH剩余酶活力受pH影响更大，因此判断，过碱的环境会导致FDH失活，从而影响催化效率。然而，不同pH条件对产物的对映选择性影响不大，产物( S )-降烟碱的e.e.值始终保持在99%以上。
图7 不同pH反应条件下IRED和FDH的剩余酶活力
2.3.2 麦斯明质量浓度对全细胞催化制备( S )-降烟碱的影响
在全细胞催化转化过程中，高底物质量浓度有利于实现高容量生产力。然而，过高浓度的底物会抑制细胞内酶的活性 。因此，按1.2.3节实验方法和1.2.5节分析方法，研究了底物麦斯明质量浓度对全细胞催化制备( S )-降烟碱的影响。在pH 7.5、200 mL的体系内包含质量浓度10~70 g/L麦斯明、质量浓度110 g/L甲酸钠、0.6 mmol/L NADP + 、700 U/L IRED细胞和700 U/L FDH细胞，于30 ℃下反应14 h，测定( S )-降烟碱的产率及e.e.值，结果见 图8
图8 麦斯明质量浓度对全细胞催化制备(
从 图8 可以看出，在全细胞催化过程中，随着麦斯明质量浓度的增加，产物( S )-降烟碱的e.e.值始终保持在99%以上。当底物质量浓度>30 g/L时，( S )-降烟碱的产率随着麦斯明质量浓度的增加而急剧下降。
测定不同底物质量浓度反应结束后的pH，结果如 表1 所示。
表1 不同底物质量浓度反应液pH
由 表1 可知，随底物质量浓度的升高，反应后体系pH也逐渐升高，而在pH 8.0~9.0条件下，FDH的酶活力损失较多（ 图5 c），另外，高质量浓度底物的存在会显著抑制IRED催化生成产物，导致产率降低 ，同时也会存在底物不完全溶解的现象，综合以上原因，( S )-降烟碱的产率急剧下降。因此，选择质量浓度为30 g/L作为最适底物质量浓度进行全细胞催化还原反应。
2.3.3 细胞添加量和添加比例对全细胞催化制备( S )-降烟碱的影响
在全细胞催化麦斯明制备( S )-降烟碱的反应过程中，反应体系中细胞添加量和添加比例也会对催化效果和反应产率产生影响，因此，按1.2.3节实验方法和1.2.5节分析方法，考察了不同细胞添加量和添加比例对反应体系的影响。在pH 7.5、200 mL的体系内包括质量浓度30 g/L麦斯明、质量浓度110 g/L甲酸钠、0.6 mmol/L NADP + 、200~700 U/L IRED细胞和FDH细胞（IRED与FDH的酶活力比值为0.75~2.00），于30 ℃下反应14 h，测定( S )-降烟碱的产率及e.e.值，结果如 图9 所示。
图9 IRED细胞和FDH细胞添加量（a）和添加比例（b）对全细胞催化制备(
由 图9 可知，随着IRED细胞和FDH细胞添加量的增加，反应的产率也随之增加，产物( S )-降烟碱的e.e.值基本保持不变。当FDH细胞酶活添加为600 U/L，IRED与FDH的酶活力比值达到1.50时，产物( S )-降烟碱产率为95%以上，继续增加比例，反应的产率保持平衡。因此在研究的范围内，综合反应产率、工业成本等问题，确定后续反应添加600 U/L FDH细胞、900 U/L IRED细胞。
2.3.4 NADP + 浓度和甲酸钠质量浓度对全细胞催化制备( S )-降烟碱的影响
IRED主要依赖NADPH提供还原力来完成生物催化过程，由于NADPH的高成本，限制了IRED在工业化规模进行生物催化的经济可行性。按1.2.3节实验方法和1.2.5节分析方法，考察了NADP + 浓度对全细胞催化制备( S )-降烟碱的影响。在pH 7.5、200 mL的体系内包含质量浓度30 g/L麦斯明、质量浓度110 g/L甲酸钠、0.1~0.7 mmol/L NADP + 、600 U/L FDH细胞和900 U/L IRED细胞，于30 ℃下反应14 h，测定( S )-降烟碱的产率及e.e.值，结果如 图10 a所示。由 图10 a可知，当NADP + 浓度为0.6 mmol/L时，在经济可行性范围内，同时在催化反应过程中能取得良好的催化效果，其产率为96%，e.e.值>99%。
图10 NADP
FDH作为NADPH再生酶，在氧化还原反应过程中可以将甲酸盐转化为CO 2 ，为IRED提供所需的NADPH。但反应所添加的甲酸钠呈碱性，添加量过少不能高效供给NADPH再生，添加量过多则会改变反应体系的酸碱度，从而影响产物的产率和e.e.值。因此，需要在反应体系中加入适量的甲酸钠，以实现NADPH再生。按1.2.3节实验方法和1.2.5节分析方法，考察了甲酸钠质量浓度对全细胞催化制备( S )-降烟碱的影响。在pH 7.5、200 mL的体系内包含质量浓度30 g/L麦斯明、质量浓度50~110 g/L甲酸钠、0.6 mmol/L NADP + 、600 U/L IRED细胞和900 U/L FDH细胞，于30 ℃下反应14 h，测定( S )-降烟碱的产率及e.e.值。甲酸钠质量浓度对全细胞催化制备( S )-降烟碱的影响如 图10 b所示。由 图10 b可知，随着甲酸钠质量浓度的增加，( S )-降烟碱的产率明显提高。当甲酸钠质量浓度达到90 g/L，此时( S )-降烟碱的产率>98%，e.e.值>99%。
因此，综合考虑工业成本、产率等因素，以NADP + 浓度0.6 mmol/L、甲酸钠质量浓度为90 g/L进行( S )-降烟碱的制备。
2.3.5 ( S )-降烟碱的最优工业制备
在IRED参与的实际生产中，引入氧化还原酶再生NADPH的方法虽然降低了一部分生产成本，但采用GDH再生NADPH的同时生成了葡萄糖酸，其繁琐复杂的分离步骤又限制了IRED的大规模生产应用。FDH再生NADPH时产生的CO 2 以其易于分离的优势，成为了IRED工业应用时的更优选择。因此，在最优条件的基础上，其他条件不变，分别添加等物质的量的甲酸钠、葡萄糖和相同酶活力的FDH和GDH，反应14 h，检测反应进程，结果如 图11 所示。
图11 IRED-FDH和IRED-GDH两种体系催化制备(
由 图11 可以看出，当采用FDH再生NADPH时，IRED催化制备( S )-降烟碱的反应在10 h达到平衡；而当采用GDH再生NADPH时，反应10 h，( S )-降烟碱的产率仅为79%。
检测反应过程中pH的变化和细胞剩余酶活力，其中，剩余酶活力以初始pH 7.5时的酶活力作为对照（100%），结果见 表2 。由 表2 可见，IRED-GDH体系pH变化较大且呈酸性，在此体系内，IRED的酶活力损失较大，酶活力仅剩余42%。这是由于体系中葡萄糖氧化产生的葡萄糖酸不断积累，降低了整个反应体系的pH，从而对IRED酶活力产生了较大影响，导致产率降低 [36-37] 。这一结果也证明了IRED-FDH催化体系除了有利于后期的产物分离这一优势，还有更好的催化效率。
表2 不同辅酶循环体系对比
此外，根据目前市场上化学试剂的官方价格对酶法生产每千克( S )-降烟碱的成本进行估算，结果见 表3
表3 酶法制备(
表3 显示，酶法制备( S )-降烟碱具有巨大经济收益。
2.4 化学法合成(
将由上述酶法催化得到的200 mL含( S )-降烟碱反应液于4 ℃、12000 r/min下离心10 min，取上清液并向其中加入40 mL多聚甲醛（0.3 mol/L）和40 mL甲酸（0.3 mol/L），将混合物逐渐升温至80 ℃，处理6 h，其中在4 h后反应完成，待液体逐渐冷却，加入40 mL氢氧化钠溶液（0.4 mol/L）碱化。用600 mL甲基叔丁基醚萃取。得到的液体使用无水硫酸钠干燥后，将混合物蒸馏，即得到( S )-烟碱， 图12 为化学法合成( S )-烟碱进程曲线。从 图12 可以看出，由高效液相色谱仪测得( S )-烟碱的产率和e.e.值均>99%。
图12 化学法合成(
3 结论
为了实现( S )-烟碱的绿色合成，本文设计了酶-化学级联反应途径。成功构建IRED-FDH双酶体系催化麦斯明合成( S )-降烟碱，研究了pH和温度对细胞中IRED和FDH酶活力的影响。结果表明，细胞中的IRED在pH 7.0~9.0、20~40 ℃时有较好的稳定性，其最适温度和最适pH分别为35 ℃和8.0；细胞中的FDH在pH 6.0~9.0、20~50 ℃时有较好的稳定性，其最适温度和最适pH分别为50 ℃和6.0。进一步地获得了优化的催化反应条件：当反应温度为30 ℃、pH 7.5时，添加质量浓度30 g/L麦斯明、600 U/L FDH细胞、900 U/L IRED细胞、0.6 mmol/L NADP + 和质量浓度90 g/L甲酸钠，反应10 h后，( S )-降烟碱的产率>98%，e.e.值>99%。通过级联化学法将酶法得到的( S )-降烟碱合成( S )-烟碱，其产率和e.e.值均达99%以上。本文设计的酶-化学级联合成( S )-烟碱的方法步骤简洁且环保高效，具有原料易得、成本低廉的经济优势，在工业生产中具有巨大的应用价值和前景，可为工业生产( S )-烟碱提供重要理论和技术支持。
后续仍存在很多潜力有待挖掘。例如：应用IRED、FDH共表达和融合技术可提高底物转化和辅酶再生速率，降低体系复杂性，有助于实现更高效率的级联反应 。将技术与生产相结合，从催化效率和成本控制两方面解决工业生产中的关键问题，促进工业化应用。
