“双碳”下金属纳米颗粒优化暗发酵制氢策略及前景
《精细化工》
2024年 41卷
第3期
20230354
中图分类号：TQ116.2；TQ920.6
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摘要
氢能是“双碳”下推动化石能源低碳转型的重要方向，推动绿氢技术的发展仍面临诸多挑战，微生物暗发酵制氢是实现生物质绿氢转化的有效途径。其中，利用具有量子尺寸效应、比表面积大和电导率高的金属纳米颗粒（MNPs）优化暗发酵制氢技术是近年来的研究热点。综述和评论了国内外添加MNPs用于优化暗发酵制氢性能的作用机制、技术难点和制氢效果等，重点阐述并比较了铁、镍和锌基三类热门MNPs优化策略在提高产氢酶系活性、增强代谢产氢途径和优化微生物群落结构等方面的作用，展望了暗发酵制氢可深入MNPs优化氢化酶活性、拓宽生物质发酵底物以及产氢菌筛选和反应器设计、生物质发酵技术开发等研究方向和应用前景。
关键词: 双碳 金属纳米颗粒 暗发酵 制氢 绿氢
氢能是一种来源广泛、清洁零碳、灵活高效且应用场所丰富的二次能源，具有科技含量高、覆盖范围广、产业链条长、社会经济效益明显，对降低能源转型社会成本、推动国家深度脱碳，构建安全清洁能源体系等方面具有重要意义。中国“3060”双碳文件《2030年前碳达峰行动方案》提出，氢能的开发利用和技术研发是实现中国能源战略转型、优化能源消费结构和保障能源安全的必经路之一，是实现工业、交通运输和建筑等领域向低碳化发展的重要战略方向 。截至2020年，中国各行业H 2 年需求量>3000万 t，预计到2060年，将猛增至13030万 t，且H 2 的供给量也将名列世界前茅。截至2022年，H 2 产量已高达2200万t（ 图1 a），而绿色氢能作为中国“双碳”战略和“十四五”可再生能源发展规划的重要发展方向，其占比却不到产量的1‰，绿氢技术缺乏及生产成本等仍是制约中国氢能发展的关键。为满足各行业日益增长的H 2 供应及“双碳”政策需求，亟需解决绿氢技术多元发展中存在的系列问题。因此，针对绿色制氢原料和途径、制氢催化剂和载体、制氢机制和条件等相关技术的深入研究极其重要。
图1 中国H
绿氢是以风能、水能、太阳能、生物质能等可再生能源制取H 2 （ 图1 b）。其中，生物质是利用光合作用提供能量而形成的一类有机体，具有来源广泛、产量巨大且可再生的优点，以农作物及其残渣、动物粪便、城市生活污水等形式存在，主要包括原始生物质（陆生、水生生物质等）和生物质废料（农业固体废料、工业废物等）等 （ 图1 c）。中国具有大量的生物质废料资源和发展空间，目前各类生物质废料保守估计高达50亿t/a，产生的总能量接近全球消耗量的6倍 。这些生物质如果没有得到妥善处理，不仅给环境、社会和居民身心健康带来巨大危害，还不能充分地循环利用资源，不符合国家“双碳”总体战略。因此，如何将这些生物质“变废为宝”，成为当今学术和工业领域亟需解决的棘手问题。中国在生物乙醇、生物柴油、生物发电、生物汽化等生物质应用领域虽然取得了显著的进步，但这些领域产生的大量糖类、醇类、酚类、酸类等生物质衍生物并没有得到很好的利用，如果能够合理利用这些糖类等生物质衍生物，将其作为原料来制取H 2 ，将进一步实现生物质的低碳转化且变废为宝。
目前，制氢方法主要包括化石能源制氢、电解水法制氢和生物质法制氢等 。其中，化石能源制氢工艺成熟且成本低廉，适合大规模制氢，但气体杂质多、碳排放和常规污染物排放量大，不符合清洁低碳的绿氢要求；电解水法制氢具有生产灵活、污染少、产氢纯度高等优点，但目前制氢电能消耗较高、转化效率低且成本高；生物质法制氢主要是通过利用厌氧微生物发酵农林废料、工业废物或生活有机废水废料等生物质废料绿色制氢，可实现大多生物质废物的持续性转化利用。因此，生物质发酵绿色制氢能实现生物质变废为宝和低碳利用，具有清洁环保、制氢纯度高且经济效应明显等特点，可分为微生物光解水制氢、光发酵制氢、暗发酵制氢和暗-光联合发酵制氢 [9-10] ，相关制氢原理和优缺点见 表1 [11-12] 。在Web of Science引文索引检索国内外近6年微生物制氢发文趋势如 图1 d所示，其中具有无需光照、环境友好、能耗低且持续性强等特点的暗发酵制氢技术 [13-14] ，被认为是最具潜力且研究最多的微生物制氢技术之一 [15-16] 。暗发酵制氢参与反应的主要是生物质底物转化的葡萄糖，在氢化酶、铁氧还蛋白和脱氢酶等一系列酶和辅酶以及中间传递体的作用下完成的生物氧化过程 [17-18] ，分为丙酮酸脱羧、甲酸分解以及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）/NAD + 平衡调节3种途径 [19-20] ，在调控细菌暗发酵制氢的这些途径中，氢化酶起着关键的催化质子还原作用。氢化酶的催化效率与产氢效率密切相关，其催化活性主要依赖于活性位点上的金属团簇，依据其活性位点结合金属的不同，又主要分为[Fe]氢化酶、[Fe-Fe]氢化酶和[Ni-Fe]氢化酶3类。金属团簇中金属元素对微生物的酶活性具有重要影响，主要起酶活性激活剂和酶辅助因子的作用，相关优化机制等研究是限制微生物暗发酵制氢进一步发展的主要技术瓶颈 。
表1 微生物法制氢技术比较
目前研究发现，金属纳米颗粒（MNPs）具有小尺寸效应、宏观量子隧道效应和较高的表面效应，能参与构成金属团簇，并加快电子向氢化酶转移，不仅能有效提高底物转化率、氢化酶等制氢酶的活性和稳定性，还能优化发酵代谢途径，进而提高微生物暗发酵制氢系统的产氢性能 [22-23] ，其作用机制如 图2 所示。
图2 金属纳米颗粒在暗发酵产氢过程中的作用机制
近年对MNPs的研究主要集中在金属单质（Fe、Ni、Zn等）、金属氧化物（如铁氧化物、镍氧化物、锌氧化物）、碳纳米颗粒和SiO 2 等 [24-26] ，其中又以用铁、镍和锌基3大金属及其氧化物在提高氢化酶暗发酵制氢活性方面最为有效。铁基NPs通过优化暗发酵代谢途径，大幅减少小分子酸的生成来提高生物质底物转化率，有效加速铁氧还蛋白和氢化酶之间电子的转移，从而显著增强[Fe]氢化酶、[Fe-Fe]氢化酶、铁氧还蛋白的活性，但其作用效果受到尺寸效应和质量浓度效应的限制，极易团聚失活 ；而镍基NPs释放出的Ni 2+ 可提高[Ni-Fe]氢化酶的活性，有效促进电子转移到电子受体，增加氢代谢通量分布，进而促进产氢，但除了会受质量浓度效应和尺寸效应限制以外，还会对微生物产生毒性作用 ；锌基NPs释放的Zn 2+ 可作为多种酶的辅助因子，能对酶系产生刺激效果以促进电子转移，减少小分子酸生成，改善微生物群落结构，尤其在促进细菌生长、代谢及提高氢产量方面可发挥重要作用，但也具有一定的毒性作用 。
本文从生物质绿色制氢的角度出发，以MNPs改善微生物暗发酵酶系活性、稳定性和制氢性能为切入点，分析和比较了在暗发酵制氢系统中添加铁、镍和锌基3类常用的MNPs优化暗发酵酶系活性的作用机制、产氢效果以及现存问题，并提出未来金属纳米颗粒暗发酵制氢优化策略可深入研究的方向。
1 铁基改性暗发酵制氢
为推动微生物暗发酵制氢技术发展，许多研究探索利用铁基NPs的量子尺寸和表面效应，通过缓慢释放Fe 2+ 、Fe 3+ 来改善制氢酶的金属团簇性质，以解决制氢酶系活性低和稳定性差的难题。[Fe]氢化酶和[Fe-Fe]氢化酶是暗发酵细菌主要的制氢酶，多存在于专性厌氧产氢菌中 [30-31] ，铁作为[Fe]氢化酶、[Fe-Fe]氢化酶、铁硫蛋白活性中心[4Fe-4S]簇和[2Fe-2S]簇上的关键元素 ，能增强制氢代谢途径中氢化酶和铁氧还蛋白的活性，有效催化电子从NADH向氢化酶转移，从而促进产氢 [33-34] ，缩短制氢停滞时间和总制氢时间，提升暗发酵系统整体的制氢性能。目前，研究较多的铁基NPs主要包括纳米零价铁（NZVI）、纳米Fe 3 O 4 （FMNPs）和纳米Fe 2 O 3 （FONPs），这些铁基NPs具有导电优良、电子转移率高且成本低等优势，合理控制其质量浓度及粒径，对提高氢化酶活性和稳定性、底物转化率以及H 2 生成等有重要的促进作用。
1.1 NZVI暗发酵制氢
ZHANG等 [35-36] 研究发现，大部分MNPs容易被微生物外层的胞外聚合物（EPS）截留而较难进入细胞，但NZVI因粒径极小，比表面积和表面能急剧增大，表现出优异的小尺寸效应、宏观量子隧道效应和较高的表面效应，在电学和化学等方面表现出独特的性质 [37-38] ，能破坏晶体的边界条件，因而极易与EPS中腐植酸类有机物形成螯合物，提高铁离子的迁移性和可利用性，在不破坏细胞完整性的情况下自由进入细胞。在进入微生物体内后，NZVI会与溶解氧发生反应，降低系统溶解氧含量（2Fe 0 + O 2 + 2H 2 O → 2Fe 2+ + 4OH – ），通过降低系统溶解氧水平来维持厌氧条件，从而降低系统的氧化还原电位（ORP），有效增强了[Fe-Fe]氢化酶的活性，促进产氢反应（Fe 0 + 2H 2 O → Fe 2+ + 2OH – +H 2 ） [39-41] 。完成制氢后，胞外EPS降解会破坏衰亡细胞的细胞膜，促进胞内NZVI等物质的释放，实现胞内NZVI的循环再利用，其作用机制如 图3 所示。
图3 NZVI颗粒促进厌氧细菌产氢的作用机制
尽管NZVI可提高厌氧产氢菌对底物的利用效率和产氢潜力，其表面效应和宏观量子隧道效应可加快电子转移，增强[Fe-Fe]氢化酶的活性和稳定性，增加产氢关键节点的代谢通量 [42-43] ，但其质量浓度过低对促进产氢效果不明显，过量则又会抑制细菌生长，导致氢产量降低，且NZVI粒径过大则易被EPS阻挡在外而不能发挥作用。为了严格调控NZVI的质量浓度和粒径，LI等 在细菌 Klebsiella sp.WL1316发酵棉秆生物质后的水解液制氢系统中加入NZVI，发现NZVI能增强该菌株的[Fe-Fe]氢化酶的活性，适宜质量浓度和粒径的NZVI可有效促进细菌生长、提高还原糖利用率和产氢效率，NZVI的最佳质量浓度和粒径分别为20 mg/L和50 nm，该条件下的氢产量最高可达(94.31±0.23) mL/g 还原糖 ，NZVI质量浓度提高后极易产生毒性，其粒径也会团聚增大，使NZVI被EPS阻挡而失活，NZVI毒性与团聚均对微生物活性产生抑制作用，导致最大产氢潜能明显降低，NZVI质量浓度为20 mg/L，粒径增至100 nm时，氢产量降至(87.42±0.13) mL/ g 还原糖 ，且氢产量随着NZVI质量浓度的增加而不断降低。
为了进一步解决NZVI易团聚失活的问题 ，BECKERS等 和范传芳 采用无机材料负载铁基NPs来降低活性位点团聚的风险，以改善氢化酶间电子转移。活性炭（AC）是NPs的最常用负载支撑材料，具有多孔吸附能力强、比表面积大、机械性能好和毒性低等特点，能有效控制铁离子释放，避免NZVI聚集团聚，不仅起到了良好的吸附剂-缓冲液作用，还有利于微生物在多孔结构的表面和内部自由生长 [48-49] 。由晓刚 用AC吸附FeCl 3 •6H 2 O制得了AC负载的NZVI（AC/NZVI），考察了其在厌氧微生物拟杆菌（ Bacterodia ）污泥暗发酵过程中的作用机制，并探究其对污泥厌氧消化的协同促进效应。AC的多孔结构且较大的比表面积使AC/NZVI表面的NZVI颗粒能高度分散（ 图4 a），增加了NZVI与微生物和有机物的接触面积，有效缓解了NZVI的团聚，提高了利用效率，促进了产氢。此外，AC/NZVI还可实现对污泥厌氧消化的协同促进效应，通过加快污泥水解酸化进程，刺激厌氧微生物持续利用有机污染物促进污泥降解，进一步提高了系统整体产氢性能，累计氢产量>6.0 mL/g VS （VS为挥发性固体），氢含量体积分数最高可达8.2%±0.5%，但产氢微生物活性在暗发酵后期会受到干扰，甲烷含量的不断增加导致了制氢停滞时间的延长，AC/NZVI组产气量达到峰值所需时间（1.65 d）比NZVI对照组（1.61 d）推迟将近1 h，持续性制氢受到一定限制。
图4 AC/NZVI的SEM图（a）
为有效解决上述制氢停滞时间较长的问题，SEWWANGI等 尝试用壳聚糖（CS）为NZVI的支撑材料。将CS溶于硝酸中，并在N 2 保护下滴加FeCl 2 和NaBH 4 ，充分混合后制得CS/NZVI，分析其对产气肠杆菌（ Enterobacter aerogenes ）暗发酵葡萄糖制氢效率的影响。结果表明，负载后的铁纳米颗粒呈球形分散包埋在CS上（ 图4 b、c），TEM显示存在自发排列的棒状结构粒子，这些结构特征明显提高了NZVI分散度，减少了颗粒聚集（ 图4 d），NZVI明显增强了氢化酶的活性，当Fe 2+ 质量浓度为150 mg/L时，氢产量最高可达243.1 mL/g 还原糖 ，高出空白对照组30%。微生物活性提高后制氢停滞时间缩短，CS/NZVI组氢产量达最大值时所需时间由空白对照组的3.6 h缩短至3.1 h。在暗发酵生物质废料制氢系统中，NZVI对发酵产氢、细菌生长和底物利用均有积极影响，且利用无机负载材料可有效解决金属纳米颗粒团聚，减少其制氢停滞时间，能协助微生物在多孔结构表面和内部自由生长，有助于提高制氢系统氢产量，为提高NZVI暗发酵系统制氢性能和持续性制氢提供了一种较为清洁且环保的研究思路。
1.2 纳米非零价铁暗发酵制氢
纳米非零价铁由于粒径小，晶体的边界条件易被破坏，使其比表面积、表面能和表面原子数急剧增加，从而表现出良好的电学性质和生物相容性 [51-52] ，已广泛应用于化工、医疗和传感器等领域 [53-54] 。在暗发酵制氢领域中，FMNPs和FONPs透过EPS进入细胞后能直接释放出Fe 2+ 、Fe 3+ ，其能参与氢化酶活性位点合成，可提高微生物制氢活性，缩短制氢停滞时间，其释放出的铁离子不仅能够促进厌氧细菌生长和底物利用，还可通过调控NADH/NAD + 水平来降低ORP，缓解氢化酶对ORP较敏感的问题 [55-56] ，但其质量浓度过高也会导致氢化酶的分子结构扭曲，且会对厌氧菌产生毒害作用，并阻碍细菌与底物接触而抑制细菌的生长和代谢 。为探究纳米非零价铁的最佳质量浓度，吴凯旋 将两类乙醇型发酵性细菌乙醇生孢产氢菌（ Hydrogenispora ethanolica LX-B）和乙醇寡食球菌（ Oligosphaera ethanolica 8KG-4 T ）放置在含有FMNPs的葡萄糖底物中暗发酵，发现FMNPs质量浓度为400 mg/L时，强化产氢效果最好，氢产量最大值为17.9 mmol/L，比空白对照组提高了28.3%。但随着FMNPs质量浓度的增加，微生物制氢能力受到抑制，质量浓度增至600 mg/L时，氢产量则降至15.1 mmol/L，只比对照组提高了6.8%。LIN等 在含产气大肠杆菌（ Enterobacter aerogenes ）的暗发酵系统中加入FONPs，当FONPs质量浓度为0~200 mg/L时，氢产量从(164.5±2.29) mL/g 葡萄糖 增至(192.4±1.14) mL/g 葡萄糖 ，当FONPs质量浓度增至400 mg/L时，氢产量则降至(147.2±2.54) mL/g 葡萄糖 ，作者认为，FONPs最佳质量浓度为200 mg/L。FMNPs和FONPs能有效降解生物质用于暗发酵制氢，具有产氢率高、成本低和可循环利用等优点，但需严格调控FMNPs和FONPs的质量浓度，为进一步推进暗发酵制氢技术的应用，还需考察如何改善纳米非零价铁在暗发酵制氢过程中因磁性团聚而失活、制氢停滞时间过长等问题 。
针对MNPs之间存在磁性吸引而引起粒子易团聚失活等问题，除了利用非金属无机材料负载NPs的方法来控制铁离子释放速率以减缓聚集团聚 ，还可将具有大比表面积的金属氧化物（M x O y ）作为支撑材料来制备铁-金属氧化物双金属复合材料以分散活性位点，金属与金属的表面相互作用不仅能降低其颗粒磁性，有效解决纳米非零价铁之间粒子团聚导致寿命缩短等问题，还可增大纳米非零价铁与微生物的接触面积和均匀分布，显著减少制氢停滞时间。YORUKLU等 使用廉价易得的M x O y （ZrO 2 、TiO 2 和Al 2 O 3 ）通过浸渍法合成FONPs掺杂金属氧化物复合材料（FONPs@M x O y ）（ 图5 a），在FONPs@Al 2 O 3 、FONPs@ZrO 2 和FONPs@TiO 2 的质量浓度均为0~200 mg/L时，筛选评估M x O y 存在下的最佳氢产量，振动磁力仪分析发现，FONPs@Al 2 O 3 磁性最低，磁参数（Mr）仅为0.02 emu/g（ 图5 b），较FONPs@ZrO 2 、FONPs@TiO 2 ，FONPs@Al 2 O 3 能够明显降低NPs磁性，更好地增大了FONPs分散度，TEM证实，FONPs能均匀分布在Al 2 O 3 颗粒表面上，且分散较好（ 图5 c）；其中，质量浓度为50 mg/L FONPs@Al 2 O 3 的暗发酵制氢效果最好，产氢量为162 mL/g 葡萄糖 ，H 2 生成速率较无NPs催化的对照组加快了近34%，制氢停滞时间缩短近30%。该研究说明，将纳米非零价铁活性位点分散在大比表面积材料上，可降低颗粒磁性、增大其分散度，以缓解团聚现象，未来可选用更廉价易得、绿色环保的M x O y 与铁基NPs复合来降低磁性，以提高暗发酵制氢效率， 表2 总结了铁基NPs在暗发酵产氢中的作用效果和H 2 产量。
表2 铁基纳米颗粒在暗发酵产氢系统中的作用效果
图5 FONPs@M
2 镍基改性暗发酵制氢
在暗发酵制氢过程中，除专性厌氧产氢菌中存在的[Fe]氢化酶和[Fe-Fe]氢化酶以外，在兼性厌氧菌中还存在[Ni-Fe]氢化酶，因其在催化氢分子可逆氧化和质子还原中起到至关重要的作用也备受关注 [63-64] ，其活性中心包含双金属Ni-Fe活性位点，对底物的亲和力较[Fe]氢化酶、[Fe-Fe]氢化酶更高 。Ni作为[Ni-Fe]氢化酶活性中心的结合金属离子之一，能有效加快电子转移并增加氢代谢通量分布以促进产氢。在暗发酵制氢过程中添加镍基NPs，能有效提高[Ni-Fe]氢化酶活性，是增强厌氧菌制氢能力的可行策略之一。目前，镍基NPs主要分为纳米氧化镍颗粒（NiONPs）和纳米镍颗粒（NiNPs），其中NiONPs对提高氢化酶的活性效果较好，但其质量浓度过高会对厌氧菌造成细胞毒性作用，而NiNPs对厌氧菌毒性更小，也可提高[Ni-Fe]氢化酶活性而促进暗发酵制氢，但同样需慎重考虑其质量浓度的影响，避免因粒子浓度过高而触发非产氢代谢途径产生过多VFAs的问题 [66-67] 。
2.1 纳米氧化镍
NiONPs作为高导电材料能加快暗发酵制氢中电子转移和中间代谢物的还原，提高[Ni-Fe]氢化酶的催化活性 ，但需合理控制质量浓度以避免细胞毒性作用，而解决NiONPs潜在的毒性作用是进一步提高氢产量的关键 。过渡金属Co是多种生物酶的必要辅助因子 ，微量存在可减少VFAs生成和细胞毒性，但质量浓度过高具有毒性 。研究发现，合理添加NiONPs和CoONPs进行协同暗发酵制氢可降低二者的细胞毒性，促进厌氧细菌细胞生长和底物消耗 。MISHRA等 研究发现，NiONPs在占比较高时可加速厌氧细菌代谢产氢，而CoONPs在占比较高时则会导致体系非产氢代谢途径增强，从而降低制氢效率，为探求二者合适占比，该研究在炭疽芽孢杆菌PUNAJAN 1（ Bacillus anthracis PUNAJAN）厌氧暗发酵后的棕榈油厂废水（POME）中加入NiONPs和CoONPs，分析NiONPs和CoONPs的最佳质量比对厌氧细菌代谢产氢能力的影响，结果表明，质量比为3∶1时制氢效果最优，产氢率达到峰值，为45 mL/h，比单NiONPs暗发酵（产氢率36 mL/h）提高了25%。在POME中添加NiONPs和CoONPs协同发酵产氢，不仅能解决单一颗粒作用因毒性受限问题，还能提高发酵系统氢产量和整体产氢性能，同时促进底物消耗，以实现有机废物的循环利用。
为进一步降低NiONPs暗发酵制氢系统毒性，SINGH等 利用植物中的次生代谢产物来绿色合成NiONPs，不仅能有效避免传统合成过程中使用试剂毒性过大的问题，将其添加至暗发酵系统中还能显著提高[Ni-Fe]氢化酶的活性。植物凤眼莲（Ec）中富含酚类、甾醇类和黄酮类等次生代谢产物 ，ZHANG等 以凤眼莲提取物为原料绿色合成纳米氧化镍（Ec-NiONPs），将其添加至克雷伯菌WL1316（ Klebsiella sp.WL1316）暗发酵木质纤维素水解物中，能改善氢合成途径中还原糖转化和代谢通量分布，增强[Ni-Fe]氢化酶相关功能基因表达，有效提高厌氧菌暗发酵制氢能力和氢产量。Ec-NiONPs最佳质量浓度为20 mg/L时，每日氢产量和最大累计氢产量分别达到(2077.00±4.23) mL/L和(4842.19±23.43) mL/L，比空白对照组分别提高了18.70%和47.29%，氢化酶活性较对照组增加了623%。绿色合成的NiONPs较好地避免了传统合成使用试剂毒性过大问题，且植物提取物在与金属离子反应期间可作为稳定剂和促进剂，能有效控制MNPs的形状和尺寸，为优化MNPs性能以提高暗发酵制氢提供了一种廉价且环保的策略。
2.2 纳米镍
暗发酵制氢过程中添加适宜质量浓度的NiNPs，可加快铁氧还蛋白与[Ni-Fe]氢化酶之间的质子和电子转移，从而增加丙酮酸产氢途径关键节点的代谢通量，对提高[Ni-Fe]氢化酶活性、促进代谢途径转变和优化暗发酵制氢均具有重要意义 [77-78] ，但NiNPs质量浓度过高也会引起细胞毒性反应，还会触发非产氢代谢途径，导致发酵底物多转化为CO 2 而抑制H 2 生成 [79-80] 。为探求NiNPs最佳使用质量浓度，ELREEDY等 在混合培养菌暗发酵含单乙二醇（MEG）工业废水的制氢系统中引入NiNPs，当NiNPs最优质量浓度为60 mg/L时，化学需氧量（COD）去除率明显提高，产氢率比未加NiNPs提高了23%，最高可达(24.73±1.12) mL/g COD ，制氢停滞时间也由4.52 h缩短至3.44 h，而当NiNPs质量浓度增至100 mg/L时，微生物活性和生长速度开始大幅减弱，产氢量也降至(20.80±1.12) mL/g COD ，累计氢产量从(44±4) mL降至(37±2) mL。表明控制NiNPs的质量浓度可促进菌落生长和底物降解，增强[Ni-Fe]氢化酶活性，从而提高累计氢产量和系统制氢效率。
NiNPs质量浓度过高除了会造成细胞毒性以外，还会导致制氢系统产生的VFAs增多而引起pH急剧下降，从而影响生物质水解速率、代谢途径和微生物细胞生长。pH过高或过低均会降低氢化酶活性，进而抑制厌氧制氢反应的进行 [82-83] ，为了降低pH对制氢系统的影响，WANNAPOKIN等 采用化学结合法将NiNPs和巴氏杆菌（ C.pasteurianum CH5）固定在凝胶中，以保持细菌生物活性实验22 d，探究共固定化法提高暗发酵系统厌氧细菌对pH耐受的可行性。研究发现，在发酵过程中会产生大量的VFAs，制氢系统pH从6.8降至4.6，但凝胶颗粒在实验前10 d内仍保持完整。FESEM显示，巴氏杆菌和NiNPs均能较好地嵌入并分布在凝胶结构中（ 图6 a和b），不仅可控制NiNPs释放到环境中的速度及质量浓度，还可让NiNPs与巴氏杆菌密切接触，为巴氏杆菌提供了很好的生存保护环境，有效提高厌氧细菌对低pH的耐受性，系统的氢化酶活性和产氢率并没有受到pH降低所带来的负面影响。通过此共固定化法释放的NiNPs最佳质量浓度为400 mg/L时，氢产量从未固定的0.49 mol/mol 葡萄糖 可直接增至1.28 mol/mol 葡萄糖 。然而14 d后，巴氏杆菌数量不断增加，导致细菌生长所需空间增多，致使部分凝胶颗粒开始出现胀破现象（ 图6 c），细菌暴露在强酸环境中，使其pH耐受性开始减弱。综上，提高暗发酵产氢率不仅要合理控制MNPs的质量浓度，还要综合考虑VFAs增多和pH改变等其他因素的影响，如何进一步提高凝胶颗粒的稳定性是今后利用共固定化法协助微生物暗发酵制氢深入研究的重要方向之一。 表3 总结了镍基NPs在暗发酵产氢系统中的作用效果和H 2 产量。
表3 镍基纳米颗粒在暗发酵产氢系统中的作用效果
图6 巴氏杆菌和质量浓度为200 mg/L的NiNPs共固定化的FESEM图（a、b）；质量浓度为200 mg/L的NiNPs和巴氏杆菌共固定化的分批实验：第5 d（c1）、第10 d（c2）、第14 d（c3）、第18 d（c4）、第22 d（c5）照片及第14 d（c6）、第18 d（c7）和第22 d近景图像（c8）（c）
3 锌基改性暗发酵制氢
Zn作为多种酶的辅助因子，能够刺激暗发酵制氢，同时作为细胞生长代谢的必需微量元素，能够维持胞内蛋白质的结构稳定，在促进细菌细胞生长、代谢和生化反应等过程中发挥着关键作用 。近年来，锌基NPs因优异的吸附特性和电学性质而成为优化暗发酵制氢性能的研究热点 [86-87] ，将其添加至暗发酵体系中可用于改善生物群落、加快电子转移和提高氢化酶稳定性，使产氢效率得到显著提升 [88-89] 。目前，研究主要集中在纳米氧化锌颗粒（ZnONPs）和纳米锌颗粒（ZnNPs）。其中，ZnONPs能提高有机物的生物降解性，促进污泥分解，在废水污泥处理和厌氧产氢强化方面具有环保意义，而质量浓度过高时易产生细胞毒性，通过探究其最优添加量可有效解决这一问题。ZnNPs毒性较ZnONPs小，不易造成细胞毒性，通过负载后还可调节系统pH稳定，提高氢化酶的活性，进而增加发酵氢产量。
3.1 ZnONPs暗发酵制氢
ZnONPs作为锌基NPs的典型代表，具有比表面积大和表面活性高的特点，能减少液体废料在厌氧制氢过程中生成CH 4 和H 2 S，可应用于废水废料处理和厌氧产氢强化，实现污染废水废料的循环利用，实现清洁H 2 的可持续转化 。为探究ZnONPs对废弃活性污泥（WAS）暗发酵氢产量的影响，ZHANG等 利用1 g ZnONPs和100 mL去离子水（pH=6.9±0.1）混合制备ZnONPs原液，探究ZnONPs对产乙酸菌厌氧暗发酵WAS制氢的作用效果，结果发现，ZnONPs透过细胞膜后可增强胞内产氢酶活性，优化微生物群落结构，从而提高厚壁菌（ Firmicutes ）和绿浮菌（ Chloroflexi ）等优势菌种丰度（达84.5%）；其次，ZnONPs不仅能提高有机物的生物降解性，还能较强地抑制WAS生成CH 4 和CH 3 COOH等过程，有效改善暗发酵体系pH因VFAs质量浓度的增加而急剧下降的现象，提高了微生物存活率和氢化酶的活性，使微生物厌氧暗发酵WAS的产氢能力有所提升。当ZnONPs含量〔以总固体（TS）质量为基准，下同〕分别为30和150 mg/g TS 时，乙酸产量较对照组（0 mg/g TS ）分别降低了10.7%和17.9%，氢产量较对照组分别提高了1.8倍和3.5倍。ZnONPs具备缓解发酵产氢系统pH下降和促进废水废料生物降解的潜力，为将来ZnONPs持续处理WAS进行可持续制氢的工艺应用提供了一种绿色且经济的策略。
在暗发酵产氢领域添加ZnONPs有利于WAS的生物利用，为进一步探究适宜的ZnONPs质量浓度，袁静 在含乙醇型发酵产氢优势菌（ Enterobacter sp.HDX08）的葡萄糖培养液中添加了ZnONPs，发现ZnONPs促进了丙酮酸的生成，而丙酮酸作为启动混合酸发酵途径的关键节点代谢产物，其含量增加可使代谢通量分布增强，进一步加快底物降解和H 2 生成。当质量浓度为200 mg/L时，ZnONPs能改善细菌生长状况，细菌的氢产量为0.45 mol/mol 葡萄糖 ，较对照组提高了36.36%。表明丙酮酸的含量变化与发酵过程的产氢速率变化呈正相关，ZnONPs的添加能够催化刺激丙酮酸途径产氢，提高暗发酵系统的产氢率和制氢性能，但ZnONPs的过量添加会诱导活性氧（ROS）大量生成，氧化损伤微生物细胞膜而释放细胞质，降低细胞活力和生存能力，严重抑制氢化酶活性 ，其添加量的深入研究有望解决暗发酵产氢量低和氢化酶活性低的瓶颈。
3.2 ZnNPs暗发酵制氢
与ZnONPs相比，ZnNPs本身毒性较低，能更好地优化微生物群落结构，以提高暗发酵氢产量，但为防止ZnNPs因磁性吸引而团聚失活，实现ZnNPs的循环再利用，WIMONSONG等 和ELREEDY等 采用载体材料负载ZnNPs来克服这一问题。载体负载法可通过提供更多的碱性位点，以缓解制氢系统pH下降趋势，提高厌氧菌落生物暗发酵制氢能力。目前，研究较多的水滑石（HT）载体具有多孔结构、大的比表面积和导电性等特点，作为ZnNPs负载材料能够为厌氧菌提供生长附着的条件、提高厌氧菌数量和生物黏附力，但会导致制氢系统出现VFAs过度累积而引起pH下降问题，降低微生物生存能力和氢产量，针对这一问题，WIMONSONG 利用椰子壳制得活性炭（TAC），通过浸渍法合成了HT/TAC负载Zn（Zn-HT/TAC）催化剂，探究其对混合培养菌厌氧暗发酵WAS的作用效果，结果发现，Zn-HT/TAC催化剂中的HT和TAC分别具有较高的弱碱位点和较强的吸附能力，两者共同作用可提高底物转化率，并减少制氢系统VFAs累积，从而缓解pH下降，提高厌氧细菌的生长能力和产氢量，Zn-HT/TAC质量浓度为8.33 g/L时，暗发酵制氢产量较无NPs催化的对照组提高了26.62%，高达3.08 mol/mol 总糖 。但HT易堵塞TAC微孔，因此Zn负载改性HT的Zn-HT浸渍TAC后，杂化催化剂的比表面积与总孔体积也降低了23.14%，其催化效率和稳定性很难再进一步提升。
为进一步增大活性炭类负载材料的比表面积和总孔体积以增强载体材料的活性，SYBOUNYA等 在活化温度为400~700 ℃的条件下，利用化学活化剂H 3 PO 4 改性商用活性炭（CAC）制得了mCAC，将其作为Zn-Ni-HT的支撑材料制备了Zn-Ni-HT/mCAC复合材料（ 图7 a），考察了该材料对接种污泥厌氧暗发酵蔗糖的作用效果。利用H 3 PO 4 改性可去除CAC孔隙中含有的酸、醇和其他化合物等杂质，通过改变CAC的官能团，使其表面孔隙增大、数目增多（ 图7 b），600 ℃下的mCAC600的吸附能力进一步增强且最优，能够较好地缓解被HT堵塞，提高氢产量（ 图7 c），在Zn-Ni-HT/mCAC600复合材料中，碱性位点较多的HT能在mCAC600表面和孔隙内均匀分布（ 图7 d），这均可减少体系中的VFAs，从而缓解发酵过程中pH的下降，提高了微生物存活率，且该复合材料缓慢释放出的Zn 2+ 等金属离子能有效加快电子转移并增强氢化酶活性，进一步提高了暗发酵氢产量（ 图7 e）。与mCAC600和Zn-Ni-HT/CAC相比，Zn-Ni-HT/mCAC600复合材料促进细菌厌氧暗发酵制氢效果最佳，氢产量高达2.958 mol/mol 总糖 ，分别提高了0.335和0.545 mol/mol 总糖 （ 图7 f）。利用载体负载颗粒的方法不仅克服了VFAs引起的pH下降问题，明显改善产氢酶系整体的活性与稳定性，还可实现材料的循环利用，降低了材料制备成本，利用双金属Zn和Ni之间的协同作用还能进一步增强微生物发酵制氢能力，为今后实现暗发酵制氢的工业化应用提供了思路。锌基NPs在暗发酵产氢系统中的作用效果和H 2 产量见 表4
表4 锌基纳米颗粒在暗发酵产氢系统中的作用效果
图7 mCAC和Zn-Ni-HT/mCAC600的制备过程（a）；mCAC的FESEM图（b）；不同温度下制备的mCAC对氢产量的作用效果（c）；Zn-Ni-HT/mCAC600的FESEM图（d）；Zn-Ni-HT/mCAC600的作用原理（e）；Zn-Ni-HT/mCAC600分别与mCAC600、Zn-Ni-HT/CAC促进产氢效果比较（f）
4 国内外氢能政策发展历程及MPS在暗发酵过程中的机制
在全球地缘政治日益复杂和俄乌局部战争背景下，全球传统化石能源与新能源氢能的生产与消费版图必将重塑，从能源供给侧着手实现全面脱碳必将成为各国研究攻关的重要方向，H 2 作为一种终端绿色零碳、应用前景广阔的二次能源，是国内外能源低碳发展和转型变革最具应用前景的能源之一，有望成为全球能源使用的终极形式 [98-99] ，中国也高度重视氢能技术与产业发展，提出要在氢能领域推动国际合作以助力“一带一路”沿线国家基础设施建设等，2022年3月发布的《氢能产业发展中长期规划（2021~2035年）》更是将氢能产业确定为战略性新兴产业和未来产业重点发展方向，明确氢能是中国未来国家能源体系的重要组成部分，将重点发展生物质、风、光、水、等可再生能源制氢， 图8 展示了近十年来国内外的氢能政策发展历程，不难看出，氢能正逐步成为中国以及全球能源转型发展的重要载体，绿色制氢技术已成为中国“十四五”期间需重点发展攻克的领域 [100-102] 。中国氢能源体系面临亟需从化石能源供给为主转变为以“可再生能源+氢”为主的绿氢体系的难关 [103-104] 。其中，生物质微生物暗发酵制氢不仅具有无需光照、原料易得和氢产量相对较高等优势，还是一条有效处理农业、工业、生活生物质废料和改善生态环境的合理途径。然而，目前暗发酵产氢的氢化酶活性较低，基础配套设施仍不足，受诸多条件限制，大多微生物制氢方法还停留在实验室研究阶段，暂未实现大规模的工业化应用。为此，美国、中国、日本等一些国家成立了专门机构，并制定了生物制氢的发展规划以期通过对生物制氢技术的基础性和应用性研究，促使该技术实现商业化生产，例如：中国提出的“863项目”对生物制氢的研究给予了大力支持和方向引导，也取得了一些可喜成绩，任南琪院士团队 研究发现，生物炭能够促进乙醇型发酵产氢，中国科学院大学余至晟团队 在利用农业废弃物发酵制氢方面取得新进展，这些研究都为实现生物制氢工业化生产奠定了基础。
图8 近十年国内外氢能政策发展历程
MNPs作为近年来的研究热点，有望解决暗发酵制氢技术难题，本文分析总结其作用的可能机制如 图9 所示 [107-110] ，其在提高暗发酵氢化酶活性和稳定性方面具有重要的研究意义，被广泛地应用在生物质微生物暗发酵绿色制氢领域。
图9 MNPs在暗发酵过程中的作用机制
5 结束语与展望
在铁、镍、锌基三类热门MNPs优化暗发酵制氢策略中，适宜质量浓度的纳米零价铁NZVI和非零价铁FMNPs、FONPs可加速铁氧还蛋白和氢化酶之间电子的转移，显著增强[Fe]氢化酶、[Fe-Fe]氢化酶和铁氧还蛋白的活性，质量浓度过低对促进产氢效果并不明显，但NZVI质量浓度过高会抑制细菌生长，并产生细胞毒性，而FMNPs和FONPs质量浓度过高则更易破坏氢化酶分子结构，并阻碍细菌与底物接触而抑制细菌的生长和代谢；同时较NZVI，非零价铁FMNPs和FONPs可直接释放出Fe 2+ 、Fe 3+ ，其参与氢化酶活性位点合成，制氢停滞时间更短，可通过CS等载体负载技术有效控制铁离子释放以调控质量浓度，分散活性位点以避免颗粒团聚失活，能协助微生物在多孔结构的表面和内部自由生长，进一步缩短铁基暗发酵制氢停滞时间并促进产氢。在镍基NPs优化策略中，NiONPs和NiNPs能够提高[Ni-Fe]氢化酶的活性，加快暗发酵制氢中电子转移，增加氢代谢通量分布以促进产氢，但NiONPs质量浓度过高会对厌氧细菌造成细胞毒性，抑制细菌细胞生长，而NiNPs毒害作用相对较小，能更好地促进代谢途径转变和微生物菌落生长，增强厌氧微生物发酵制氢能力，然而NiNPs质量浓度过高会更易导致制氢体系VFAs的积累，使pH下降而影响氢化酶活性，该策略可利用双金属协同添加、共固定化等技术来有效降低镍基NPs细胞毒性，进一步提高暗发酵体系厌氧细菌对pH的耐受性，增加优势菌种丰度，提高累计氢产量和系统制氢效率。锌基NPs中的ZnONPs和ZnNPs释放出的Zn 2+ 可作为多种酶的辅助因子，能够对酶系产生刺激效果以促进电子转移，提高暗发酵系统微生物丰度和制氢性能，其中ZnONPs能明显提高生物质的生物降解，促进废水废料微生物分解，对强化厌氧暗发酵产氢效果较好，但质量浓度过高毒性较强，易诱导ROS生成而氧化损伤微生物细胞膜，降低厌氧菌的活力和生存能力，而ZnNPs毒性则更小，更不易造成细胞毒性，但其更易因磁性吸引而团聚失活，循环利用性能较低，该策略可利用载体负载法、双金属协同作用等方法来控制颗粒释放质量浓度、提供更多碱性位点，缓解由VFAs引起的pH下降趋势，改善产氢酶系整体的活性与稳定性，提高厌氧微生物暗发酵制氢能力。综上，相比于镍基NPs和锌基NPs，目前，铁基NPs添加策略的研究及其应用最为广泛，制备成本较低且环境效益较好，用于暗发酵制氢能更好地提高微生物制氢能力和系统氢产量。因此，针对MNPs最优添加量和负载技术等方面的深入研究有望解决暗发酵氢化酶活性低和产氢量低的瓶颈问题，同时在MNPs优化氢化酶催化活性、生物质发酵底物拓宽、高效产氢微生物筛选和制氢反应器设计、以及新型生物质发酵技术开发等方面也仍面临诸多挑战，为拓宽其在暗发酵制氢中的应用前景，推动生物质绿色制氢工业化进程，提出未来绿色发酵制氢技术可从以下4个方面开展更深入的研究：
（1）MNPs优化氢化酶活性方面，目前暗发酵制氢研究过程中多采用单一MNPs添加，较难避免MNPs在高质量浓度下干扰细胞代谢，从而产生细胞毒性，通过深入双金属协同作用发酵制氢研究，探索双金属协同使用和作用机制，不仅能克服单一颗粒作用因毒性受限问题，还能提高发酵系统氢产量和整体制氢性能，同时促进底物消耗利用以实现有机废物的循环利用。例如：Ni和Co作为细胞生长不可缺少的元素和辅助因子，能有效转移电子以增强氢化酶活性，Ni 2+ 可提高[Ni-Fe]氢化酶的活性，增加氢代谢通量分布，从而促进产氢，Co 2+ 可加速代谢反应，调节代谢产氢途径以提高氢产量，但二者均受质量浓度效应和毒性效应限制，合理添加NiONPs和CoONPs进行协同发酵制氢能降低二者产生的细胞毒性，促进厌氧菌细胞生长和底物降解。
（2）生物质发酵底物拓宽方面 [111-112] 。东方电气集团和重庆市政府合作的垃圾制氢项目作为国内首个垃圾制绿氢示范项目，目前已实现每吨垃圾制取20~40公斤左右绿氢的目标 。今后研究除大力开发生活垃圾和工农业废水废弃物原料、传统木质纤维素生物质等原料发酵制氢以外，还可对海洋生物质（如海藻类）和海洋微生物制氢菌种进行深入研究，通过开发利用海洋生物质发酵制氢的有效微生物链，实现发酵产氢、环境保护和生物质高效利用等多个目标，促进从以淡水暗发酵细菌生物制氢为研究主体逐渐向海洋微生物发酵制氢方向转变，进一步发掘暗发酵海洋细菌生物质发酵制氢潜力和海洋能源生产的双重功效。
（3）产氢菌筛选和制氢反应器方面 。深入探索基因工程手段改造或诱变出高氢转化效率的厌氧暗发酵菌株，从源头提高生物质发酵制氢氢产量和效率，同时不断改进生物反应器设计和优化生物质暗发酵制氢反应器结构，如同济大学赵有才团队 评价了新型半连续式厌氧转鼓反应器（SARD）与连续搅拌槽式反应器（CSTR）发酵产氢的效果，结果发现，SARD的运行效果优于CSTR，且半连续运行比序批式运行的效果更佳，产氢细菌数量和氢产量均得到明显提高，相关反应器的设计改造值得进一步研究。
（4）生物质发酵技术方面 [116-118] 。利用暗发酵的副产物VFAs可作为光发酵生物制氢底物这一特性，深入探究暗-光发酵制氢机制，充分发挥两者各自优势，同时接种基因工程改造的光-暗发酵优势菌，再通过利用植物中的次生代谢产物来绿色合成高稳定性的MNPs，减少暗-光发酵制氢体系中毒性化学试剂使用，充分考虑生物相容性、发酵基质和接种菌种等因素，推进生物质发酵技术研究。
未来，为引导氢能产业健康有序发展，政府应高度重视以下几个方面并持续发力 [119-120] ：（1）应统筹推进氢能基础设施建设，合理布局制氢设施，稳步构建储运体系，统筹规划加氢网络；（2）需稳步推进氢能多元化示范应用，有序推进交通领域示范应用，积极开展储能领域示范应用，合理布局发电领域多元应用，逐步探索工业领域替代应用；（3）要加快完善氢能发展政策和制度保障体系，建立健全氢能政策体系，建立完善氢能产业标准体系、加强全链条安全监管；重点要系统构建支撑氢能产业高质量发展创新体系，提升关键核心技术水平，着力打造产业创新支撑平台，推动建设氢能专业人才队伍，积极开展氢能技术创新国际合作，早日推进实现生物质暗发酵制氢工业化。
