玉米醇溶蛋白/鱼腥草黄酮复合纳米颗粒的制备及胃肠道释放特性
《精细化工》
2024年 41卷
第6期
20230492
中图分类号：TB383.1；TS201.2
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全文 图表 参考文献 作者 出版信息
摘要
为提高鱼腥草黄酮（Houttuynia cordata flavonoids，HCF）的稳定性，以玉米醇溶蛋白（Zein）和HCF 为原料，采用反溶剂法制备了Zein/HCF 复合纳米颗粒，探究了Zein、HCF 质量比对复合纳米颗粒的影响，并对其进行了表征。结果表明，HCF 与Zein 之间存在氢键、疏水及静电相互作用。当m(Zein)∶m(HCF)=20∶3 时，制备的Zein/HCF 复合纳米颗粒性能最好，其熔融温度最高（85.09 ℃），比Zein 纳米颗粒（72.25 ℃）增加了12.84℃；其平均粒径、多分散性指数最小、粒径分布最窄、Zeta 电位绝对值及包封率最大，微观结构呈均匀分散的圆球状；其具有较高的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼、2,2'-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐自由基清除能力，具有较好的热处理保护能力，在模拟消化过程中，经胃液消化120 min 后HCF 释放率仅为22.31%，再加入肠液消化120 min 后，HCF 释放率达到75.66%。HCF 在模拟胃肠液中的释放趋势均符合Ritger-Peppas 模型，但释放机制不同，胃液中属非Fick 扩散机制，肠液中属Fick 扩散机制。
关键词: 鱼腥草黄酮 玉米醇溶蛋白 纳米颗粒 胃肠道释放特性 食品用化学品
植物蛋白质和黄酮类化合物作为食品基质的重要组成成分，其相互作用及相关变化在食品加工中具有重要意义 。研究表明，黄酮类物质对植物蛋白质具有显著的结合亲和力，二者通过芳香基团的疏水堆积，或黄酮类物质的基团和蛋白质链的共价或非共价相互作用交联，导致蛋白质空间结构发生变化，对其功能特性造成影响，形成具有独特的物理和化学特性的植物蛋白-黄酮复合物 。黄酮与蛋白质的结合也会影响这两种成分的生物利用度，进而对食品的理化性质造成一定影响 。因此，关于植物蛋白质与黄酮相互作用的研究已经成为时下热门之一。鱼腥草（ Houttuynia cordata Thunb.）为药食同源植物，具有清热解毒、去痈排脓、利尿通淋等功效 。鱼腥草含多种活性成分，其中黄酮类含量最为丰富，以槲皮甘、金丝桃苷、异槲皮苷、芦丁等类黄酮为主，具有较好的抗氧化、抗炎、抑菌等作用 。但槲皮素等黄酮类化合物不稳定，易受物理、化学和生理等因素影响而氧化、降解，进而影响其潜在治疗活性，在医药和食品加工方面的应用受到较大限制 。为克服这一缺点，可以通过纳米运载技术解决生物活性物质的水溶性和稳定性问题，如纳米乳液 、生物聚合物纳米颗粒 、微胶囊 和脂质体 等。
食品级纳米颗粒通常采用食品级高分子材料为载体，如蛋白质和多糖，这种载体具有良好的生物相容性、生物可降解性、安全性，已被广泛应用于疏水生物活性化合物的包封和递送 。玉米醇溶蛋白（Zein）是玉米中主要的储存蛋白，含大量疏水氨基酸残基，溶于乙醇水溶液而不溶于水，能够与活性物质通过自组装形成纳米复合物 ，提高天然活性物功能性成分的稳定性、生物活性，同时改善Zein 的功能特性 。许雪儿等 采用反溶剂法制备的负载生育酚的Zein 复合纳米颗粒稳定性较好，在模拟胃肠液中具有较好的缓释性能；WANG 等 制备了负载大麻二酚（CBD）的Zein 纳米颗粒，其提高了CBD 的体外抗氧化性；YANG 等 制备的枸杞多糖/Zein 复合纳米颗粒提高了姜黄素的生物可及性及生物活性。目前，关于制备Zein、鱼腥草黄酮（ Houttuynia cordata flavonoids，HCF）复合纳米颗粒的研究鲜有报道。
基于此，本文拟采用反溶剂法来制备Zein/HCF复合纳米颗粒，研究复合纳米颗粒的结构、性质，探讨不同Zein 与HCF 质量比对复合纳米颗粒形成的影响；考察复合纳米颗粒的抗氧化性、稳定性及胃肠道消化特性。以期解决HCF 稳定性差的问题，为拓宽HCF 在食品领域的应用提供理论依据。
1 实验部分
1.1 试剂与仪器
鱼腥草全根，云南省昆明市寻甸县金所乡；Zein，分析纯，上海麦克林生化科技股份有限公司；纤维素酶（比活≥35 U/mg）、胃蛋白酶、胰蛋白酶（比活≥250 U/mg），南京都莱生物技术有限公司；AB-8 大孔吸附树脂、芦丁标准品，（HPLC 纯度≥98%），上海源叶生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2,2'-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐（ABTS），HPLC 纯度≥98%，合肥巴斯夫生物科技有限公司；其余化学试剂均为分析纯。
SB25-12DTDS 超声波清洗仪，宁波新艺超声设备有限公司；FD5-3 真空冷冻干燥机，北京华夏莱博仪器仪表有限公司；650 型傅里叶变换红外光谱仪，天津港东科技有限公司；UV-2600 紫外-可见分光光度计，日本Shimadzu 公司；SmartLab SE 型X射线衍射仪，日本理学株式会社；DSC204 型差示扫描量热仪，德国Netzsch 公司；Sigma 300 场发射扫描电子显微镜，德国Carl Zeiss 公司；Zetasizer Nano ZS90 型纳米粒度及Zeta 电位分析仪，英国Malvern 仪器有限公司。
1.2 制备方法
1.2.1 HCF 的提取纯化
HCF 的提取参照杨宗玲等 的方法略作修改：鱼腥草全根去除须根，蒸馏水洗净，50 ℃干燥12 h，粉碎，过60 目筛，取筛下物得鱼腥草粉。准确称取5.00 g 鱼腥草粉，以料液比（g∶mL，下同）1∶30加入质量分数50%的乙醇水溶液，以0.1 mol/L 冰乙酸调节pH=5.0，500 W 超声50 min，加入0.25 g 纤维素酶，45 ℃酶解30 min，90 ℃灭酶5 min，抽滤，旋蒸浓缩后-60 ℃冻干24 h 得到黄酮粗提物。参照毕会敏等 的方法纯化HCF。准确称取1.00 g 黄酮粗提物溶解于1 mL 无水乙醇中，蒸馏水定容至100 mL，加入2 g AB-8 大孔树脂，37 ℃振荡吸附24 h（120 r/min）。抽滤，蒸馏水冲洗，滤饼加入质量分数75%乙醇水溶液100 mL，37 ℃振荡解吸7 h。抽滤，滤液旋蒸浓缩后-60 ℃冻干24 h 得纯化HCF。
1.2.2 Zein/HCF 纳米颗粒的制备
参照杨婷婷等 的方法，略作修改。配制质量浓度为20 g/L Zein-乙醇溶液（溶剂中乙醇质量分数为80%），37 ℃，1000 r/min 磁力搅拌50 min，置于冰箱4 ℃冷藏12 h，使其充分水合。取50 mL Zein-乙醇溶液，加入纯化后的HCF，使 m (Zein)∶ m (HCF)=20∶0、20∶1、20∶2、20∶3、20∶4、20∶5，超声至完全溶解。将Zein-HCF 乙醇溶液缓慢滴入50 mL 蒸馏水中，1000 r/min 持续搅拌 30 min。旋蒸浓缩后，8000 r/min 冷冻（4 ℃）离心5 min，取上清液-60 ℃冻干24 h 得Zein/HCF 复合纳米颗粒。
1.3 表征与性能测试
1.3.1 HCF 纯度的测定
参照孙艺炜 的方法，略作修改。取4 mg HCF纯化物，用质量分数54%乙醇水溶液定容至25 mL，取1 mL 样品液分别加入0.3 mL 质量分数为5%亚硝酸钠水溶液、质量分数为10%硝酸铝水溶液，摇匀，静置6 min，再加入4 mL 质量分数为4%氢氧化钠水溶液，用质量分数50%乙醇水溶液定容至10 mL，摇匀，静置15 min，采用紫外-可见分光光度计在510 nm处测其吸光度。通过芦丁标准曲线方程（ y =11.51 x -0.0029， R 2 =0.9993）计算HCF 纯度为86.71%±0.02%。
1.3.2 FTIR 测试
用傅里叶变换红外光谱仪测定单一组分HCF及复合纳米颗粒的FTIR 光谱。测定波数为4000～400 cm -1 ，分辨率为4 cm -1 ，扫描次数为32 次。采用软件PeakFit v4.12 对复合纳米颗粒蛋白质二级结构进行计算。
1.3.3 XRD 测试
采用XRD 对单一组分HCF 及复合纳米颗粒进行结晶结构测试。测试条件：以Cu K α 靶射线为辐射源，扫描速率为2 (°)/min，扫描范围为5°～40°。
1.3.4 热稳定性测试
采用差示扫描量热仪测试样品的热稳定性。准确称取5 mg 样品于坩锅中，以空坩埚为空白对照，扫描温度范围为25～150 ℃，升温速率为10 ℃/min，氮气流速为20 mL/min。
1.3.5 粒径、多分散性指数（PDI）、Zeta 电位测试
利用纳米粒度及Zeta 电位分析仪测试复合纳米颗粒的粒径、PDI 以及纳米颗粒剪切面的Zeta 电位。以水为分散剂，折射率为1.330。
1.3.6 包封率测试
参照CHEN 等 的方法，略作修改。取20 mg冻干后的复合纳米颗粒溶于质量分数85%乙醇水溶液，8000 r/min 离心5 min，取上清液1 mL 按1.3.1节方法测定HCF 含量。复合纳米颗粒对HCF 的包封率按式（1）进行计算：
式中： m 1 为上清液中HCF 的质量，g； m 2 为复合纳米颗粒中HCF 添加质量，g。
1.3.7 SEM 测试
利用SEM 观察纳米颗粒的形态结构，加速电压3 kV，放大倍数2000 倍。
1.3.8 抗氧化性测试
参照REN 等 的方法测定HCF、复合纳米颗粒的DPPH·、ABTS + ·清除率。
将复合纳米颗粒用质量分数80%乙醇水溶液溶解，配制成质量浓度为5 g/L 的样品液。取2 mL 样品液于比色管，加入2 mL 浓度为0.1 mmol/L 的DPPH-乙醇溶液，37 ℃避光保存30 min，以无水乙醇为参比，采用紫外-可见分光光度计在517 nm 处测吸光度；对照组是在2 mL 无水乙醇中加入2 mL样品液，采用紫外-可见分光光度计在517 nm 处测溶液吸光度；空白组是在2 mL 无水乙醇中加入2 mL浓度为0.1 mmol/L 的DPPH-乙醇溶液，采用紫外-可见分光光度计在517 nm 处测溶液吸光度。V C 标准液为阳性对照。DPPH·清除率按式（2）计算：
式中： A 1 为样品液吸光度； A 2 为对照组吸光度； A 3 为空白组吸光度。
测定前取ABTS 水溶液（7 mmol/L）与过硫酸钾水溶液（2.45 mmol/L）等体积混匀，室温下避光静置12 h 得ABTS 母液。测定时用无水乙醇稀释至吸光度为0.70±0.02 得到ABTS 测定液。取0.5 mL样品液于比色管，加入5 mL ABTS 测定液，混匀，室温反应20 min，以蒸馏水为参比；对照组取0.5 mL不同浓度的样品液，加入5 mL蒸馏水；空白组取0.5 mL蒸馏水，加入5 mL ABTS 测定液。以上溶液均采用紫外-可见分光光度计在734 nm 处测定其吸光度。V C 标准液为阳性对照。ABTS + ·清除率按式（3）计算：
式中： A 4 为样品液吸光度； A 5 为对照组吸光度； A 6 为空白组吸光度。
1.3.9 加热稳定性测试
复合纳米颗粒在不同加热温度的稳定性参照YANG 等 的方法，略作修改。将制备好的复合纳米颗粒悬浮液或HCF 溶液在40、60、80 ℃水浴中加热30 min，测量上清液中HCF 含量。通过测定纳米颗粒中HCF 保留率评价加热稳定性，HCF 保留率按式（4）进行计算：
式中： ρ 1 为加热后上清液中HCF 质量浓度，g/L； ρ 2 为初始HCF 质量浓度，g/L。
1.3.10 体外消化特性测试
参照许雪儿等 的方法略作修改，模拟胃液（SGF）的制备：将0.32 g 胃蛋白酶溶解于100 mL蒸馏水中，用浓度为1 mol/L 盐酸调节胃蛋白酶水溶液pH=2.0；模拟肠液（SIF）的制备：将0.20 g 胰蛋白酶、1.20 g 胆盐、0.88 g 氯化钠溶于质量分数为0.68%的磷酸二氢钾水溶液，用浓度0.1 mol/L 的NaOH 水溶液调节混合溶液pH=7.2。将复合纳米颗粒悬浮液与等体积SGF 混合，于恒温振荡培养箱中37 ℃、120 r/min 消化120 min。胃消化后，用0.1 mol/L NaOH 溶液调节pH=7.2，并与等体积SIF 混合，37 ℃、120 r/min 消化180 min。HCF 释放率按式（5）进行计算：
式中： m 1 为消化液中HCF 质量，g； m 2 为HCF 包封量，g。
1.4 数据处理
所有实验均设3 组平行，采用软件IBM SPSS Statistics 26 进行统计分析，通过Duncan 检验和方差分析（ANOVA）对数据进行差异显著性分析（ P ＜0.05），用软件Origin 2018 绘图。
2 结果与讨论
2.1 FTIR 分析
图1 为单一组分HCF 和复合纳米颗粒的FTIR谱图。
图1 HCF 及复合纳米颗粒的FTIR 谱图
从 图1 可见，HCF 在3387.8、2924.6、1612.2和1519.8 cm -1 处显示出特征吸收峰，分别归属于O—H、—CH 2 、芳环C==C 键的伸缩振动 。Zein位于3311.1、1656.5、1538.9 和1451.5 cm -1 处的吸收峰，分别与O—H 键的伸缩振动、C==O 键的伸缩振动（酰胺Ⅰ带）、C—N 键的伸缩振动和N—H 键的弯曲振动（酰胺Ⅱ带）有关 [21-22] 。在复合纳米颗粒的FTIR 谱图中，HCF 的特征吸收峰消失或与封装载体材料Zein 的吸收峰重叠，原因为纳米载体的包裹限制了HCF 化学基团的伸展，说明HCF 被成功包埋在纳米颗粒疏水内部。刘钱媛 也发现类似现象：负载紫檀芪的Zein、褐藻糖胶复合物的FTIR谱图中没有出现紫檀芪的特征吸收峰。与纯Zein 组分〔 m (Zein)∶ m (HCF)=20∶0〕相比，复合纳米颗粒〔 m (Zein)∶ m (HCF)=20∶2～20∶5〕的O—H 吸收峰均向高波数偏移，表明Zein 与HCF 间有氢键形成 。而酰胺Ⅱ带吸收峰的轻微偏移则表明复合纳米颗粒形成过程中存在静电相互作用力 。 图2 为复合纳米颗粒的蛋白质二级结构含量。
图2 复合纳米颗粒的蛋白质二级结构含量
从 图2 可见，Zein 纳米颗粒二级结构 α -螺旋、 β -折叠、 β -转角、无规则卷曲含量分别为33.50%、19.24%、33.28%、13.98%。与纯Zein 组分〔 m (Zein)∶ m (HCF)=20∶0〕相比， m (Zein)∶ m (HCF)=20∶1 复合纳米颗粒的 α -螺旋、 β -转角含量分别增加0.20%、1.30%， β -折叠、无规则卷曲含量分别减少1.04%、0.47%，说明加入HCF，Zein 二级结构发生改变，但此时蛋白质分子内氢键较少，结构较为松散。与纯Zein 组分相比， m (Zein)∶ m (HCF)=20∶2～20∶3复合纳米颗粒的 α -螺旋含量减少15.93%～16.39%， β -折叠含量增加12.86%～13.43%、 β -转角含量增加0.28%～1.47%， α -螺旋含量减少， β -折叠、 β -转角含量增加说明蛋白质分子伸展，HCF、Zein 分子间形成氢键，复合纳米颗粒的结构趋于有序化。综上所述，氢键、静电力和疏水效应等相互作用是组装Zein/HCF 复合纳米颗粒的主要驱动力。
2.2 XRD 分析
图3 为HCF 及复合纳米颗粒的XRD 谱图。从 图3 可见，复合纳米颗粒在2 θ= 9.0°和20.9°出现两个宽峰，是由Zein 和HCF 分子间的相互作用所导致的，表明复合纳米颗粒为无定形结构。单一组分HCF 表现出锐利的衍射峰，主要分布在2 θ= 9.6°、15.8°、20.2°，表明HCF 呈高晶化形态 。将HCF包封到复合纳米颗粒中，所有复合纳米颗粒中均未观察到纯HCF 的尖锐特征晶峰，说明HCF 的状态由结晶态转变为无定形态，也表明HCF 被成功包埋在Zein 纳米颗粒中。与张园园等 研究的将 α -硫辛酸装载到Zein 纳米颗粒中特征峰消失的特征一致。此外，在2 θ= 9.0°和20.9°，随着HCF 用量的增加〔 m (Zein)∶ m (HCF)=20∶0～20∶3〕，峰值强度变大，说明表明复合纳米颗粒分子间有序性增加。而过量HCF〔 m (Zein)∶ m (HCF)=20∶4～20∶5〕添加到复合纳米颗粒后，样品峰值强度减小，说明过量的HCF 会破坏分子间的有序性，分子间氢键作用减弱，无定形区增加，结晶度降低 。
图3 HCF 及复合纳米颗粒的XRD 谱图
2.3 热稳定性分析
不同Zein、HCF 质量比复合纳米颗粒的DSC曲线如 图4 所示。由 图4 可知，单一组分HCF、Zein纳米颗粒、复合纳米颗粒均在30～150 ℃内出现吸热峰，且DSC 曲线趋势相似。单一组分HCF、Zein纳米颗粒、复合纳米颗粒〔 m (Zein)∶ m (HCF)=20∶1～20∶5〕的熔融温度分别为82.40、72.25、82.37、84.89、85.09、82.60、77.62 ℃。Zein 纳米颗粒热稳定性较差（72.25 ℃）是因为纳米颗粒的形成破坏了Zein 原有的整体结构。LIU 等 的研究结果也有类似现象。加入HCF 后，复合纳米颗粒熔融温度增加，说明热稳定性增强，是因为HCF 的加入改变了蛋白质二级结构，HCF 与Zein 分子间形成强相互作用（FTIR 结果可知），延迟了分子链的运动，增加体系交联密度。然而，当 m (Zein)∶ m (HCF)=20∶4～20∶5 时，复合纳米颗粒熔融温度降低。原因是过量的HCF 导致Zein 桥接和絮凝，进而导致热稳定性降低。 m (Zein)∶ m (HCF)=20∶3 时熔融温度最高（85.09 ℃），与Zein 纳米颗粒（72.25 ℃）相比增加了12.84 ℃，说明在此配比下，各组分之间的相互作用最强，热稳定性最好，热稳定性的增加有利于保护HCF 的稳定性和生物活性。XIA 等 研究结果表明，Zein 与山苍子油（LCO）间存在的氢键相互作用使复合纳米颗粒具有良好的热稳定性，但过量的LCO 会导致蛋白质发生絮凝，破坏分子间稳定结构，导致热稳定下降。
图4 HCF 及复合纳米颗粒的DSC 曲线
2.4 粒径、PDI、Zeta 电位分析
复合纳米颗粒的平均粒径、PDI、粒径分布如 图5 a、b 所示。从 图5 a、b 可以看出，使用反溶剂法制备的复合纳米颗粒平均粒径主要在150～300 nm 之间，PDI 均在0.2 以内，粒径分布均呈单峰分布。Zein 纳米颗粒平均粒径、PDI 分别为(234.6±10.3) nm、0.176±0.045。研究表明，粒径大小受配方组成和制备方式影响，Zein 用量越低、乙醇含量越高、搅拌速度越快，制得的纳米颗粒粒径越小，对纳米颗粒制备条件进行优化，可得到粒径较小的复合纳米颗粒 。 m (Zein)∶ m (HCF)=20∶1～20∶3 时，随HCF用量的增加，复合纳米颗粒的粒径分布均呈单峰分布并逐渐集中，平均粒径、PDI 逐渐减小， m (Zein)∶ m (HCF)=20∶3 时粒径分布最集中，平均粒径和PDI最小，分别为(180.4±4.9) nm、0.063±0.027，与Zein纳米颗粒相比，分别降低23.1%、64.2%。这是由于在抗溶剂过程中，足够多的HCF 分子快速到达Zein聚集体的表面，并均匀分布在颗粒上，纳米颗粒间强大的静电斥力和空间位阻能有效阻止颗粒间的聚集，因此体系中桥状絮凝现象减弱。随着HCF 用量的继续增加， m (Zein)∶ m (HCF)=20∶4～20∶5 复合纳米颗粒平均粒径、PDI 逐渐减大，粒径分布逐渐变宽。原因为过量HCF 分子的加入破坏了分子间稳定性，并形成了絮凝结构。
图5 复合纳米颗粒的平均粒径、PDI（a）及其粒径分布（b）
Zeta 电位通常表示纳米颗粒携带的表面电荷情况，是表征胶体分散体系稳定性的重要指标。 图6 为复合纳米颗粒的Zeta 电位。
图6 复合纳米颗粒的Zeta 电位
胶体分散体系中纳米颗粒Zeta 电位绝对值越大，颗粒间存在的静电斥力越大，能阻止纳米颗粒在胶体溶液中聚集，从而胶体体系的稳定性越好 。由 图6 可知，复合纳米颗粒的Zeta 电位分布在-20～-30 mV 之间，电位均为负值。当Zein 与HCF 的质量比发生变化时，它们所带的电荷量比值会随之改变，直接影响到Zein 和HCF 之间的相互作用力大小，从而影响复合纳米颗粒的稳定状态。与Zein 纳米颗粒相比，加入HCF 后纳米颗粒的Zeta 电位绝对值均显著提高（ P＜ 0.05）。随着HCF 用量的增加， m (Zein)∶ m (HCF)=20∶0～20∶5 复合纳米颗粒的Zeta 电位绝对值先上升后下降， m (Zein)∶ m (HCF)=20∶3 时，Zeta 电位绝对值达到最高，说明Zein 表面电荷增加，颗粒之间的静电排斥力增强，有利于阻止颗粒间聚集。
2.5 包封率分析
复合纳米颗粒的包封率如 图7 所示。从 图7 可见，随HCF 用量的增加， m (Zein)∶ m (HCF)=20∶1～20∶5 复合纳米颗粒包封率呈先增大后减小的趋势，包封率均在80%以上，表明HCF 能被较好地包埋在 Zein 纳米颗粒中。 m (Zein)∶ m (HCF)=20∶1～20∶3 时，随着HCF 用量的增加，复合纳米颗粒包封率由83.24%显著提高至92.19%（ P ＜0.05）， m (Zein)∶ m (HCF)=20∶4 时，包封率下降，这可能与纳米颗粒中HCF 的过饱和有关。此外，由于过量的HCF 导致部分Zein 聚集成大颗粒并沉积，制备过程中分离的沉积物增加，导致包封率逐渐下降。在Zein 对山苍子油的包封也出现类似现象 。
图7 复合纳米颗粒对HCF 的包封率
2.6 SEM 分析
采用SEM 观察纳米颗粒的微观结构和表面形态，结果见 图8 。在反溶剂制备过程中，Zein 由松散状态自组装形成固体球形颗粒，并通过氢键、范德华力、疏水相互作用、 π-π 相互作用等驱动力将HCF 包埋在Zein 纳米颗粒内部。
图8 复合纳米颗粒的SEM 图
如 图8 a、b 所示，Zein 纳米颗粒粒径较大，且出现团聚现象。 m (Zein)∶ m (HCF)=20∶3 的复合纳米颗粒具有球形结构，颗粒分布、大小相对均匀，这与使用动态光散射法（DLS）测得的粒径结果一致。Zein 纳米颗粒由于极高的疏水性和不稳定性更容易聚集，而Zein/HCF 复合纳米颗粒由于HCF 的加入使颗粒间静电斥力增强，提供了更大的粒子间空间排斥。
2.7 体外抗氧化性分析
采用DPPH、ABTS 实验评估复合纳米颗粒的抗氧化性能，V C 为对照，自由基清除率越大说明样品的抗氧化活性越强。不同HCF 质量浓度及复合纳米颗粒抗氧化活性结果如 图9 所示。
图9 不同质量浓度HCF 对DPPH·、ABTS
由 图9 a 可知，随着HCF 质量浓度的增加，DPPH·、ABTS + ·清除率增加，分别为 72.40%～88.22%、96.11%～99.51%。在氧化反应中，黄酮类化合物如槲皮素等可以提供氢原子与自由基发生反应，形成醌类游离中间体，并在酚环共轭作用下趋于稳定，阻断氧化链的传递，防止过氧化反应 。由 图9 b 可知，Zein 纳米颗粒对DPPH·、ABTS + ·清除率分别为41.85%、38.57%。Zein 纳米颗粒具有一定的清除自由基能力，这是因为，Zein 在反溶剂法制备纳米颗粒中蛋白质结构发生变化生成游离巯基，与WANG 等 的研究结果一致。复合纳米颗粒对DPPH·、ABTS + ·清除率随着体系中HCF 用量的增加而增加，分别为 70.99%～81.38%、89.16%～98.29%。复合纳米颗粒较高的抗氧化活性主要来源于HCF 具有的强抗氧化能力。游离HCF 自由基清除能力高于复合纳米颗粒，原因为HCF 部分酚羟基与蛋白发生相互作用，降低了HCF 与自由基碰撞的几率，导致复合纳米颗粒的抗氧化性低于游离多酚 。但复合纳米颗粒的抗氧化性均低于V C 。此外，游离HCF 及复合纳米颗粒对 ABTS + ·清除效果均优于DPPH·，原因为不同自由基的氧化作用机制存在差异。
2.8 加热稳定性分析
图10 为温度对HCF 保留率的影响。
图10 温度对HCF 保留率的影响
HCF 被认为是一种稳定性差的黄酮类化合物，研究表明，加热等因素会导致黄酮类化合物降解并失去其生物活性，测定复合纳米颗粒在不同加热温度下的HCF 保留率，可一定程度反映出复合纳米颗粒的环境稳定性。如 图10 所示，不同温度加热后，复合纳米颗粒中HCF 保留率均高于游离HCF，说明复合纳米颗粒具有较好的热处理保护能力。然而，随着温度的升高，嵌入在复合纳米颗粒中的HCF 也会发生降解，但降解速度明显低于游离HCF，其中 m (Zein)∶ m (HCF)=20∶3 时复合纳米颗粒的表现出较好的热保护能力，加热温度为80 ℃，HCF 保留率为81.29%，游离HCF 保留率仅为51.84%。
2.9 模拟胃肠释放分析
人体胃肠道中HCF 的控制释放非常重要，影响其生物可及性和生物利用度。HCF 在SGF 和SIF 中的体外释放如 图11 所示。
图11 HCF 在模拟胃肠液中的释放
由 图11 可知，游离HCF 的生物可及性较低，SGF 消化后仅检出20.98%。在SGF 消化过程中，复合纳米颗粒表现出较低的持续释放，SGF 消化120 min后HCF 释放率仅为22.31%，说明复合纳米颗粒可以保护HCF 不受胃蛋白酶的影响，这是因为，Zein在酸性环境中溶解度较低， α -玉米蛋白二聚体不能在胃蛋白酶中被消化。WANG 等 研究表明，Zein包埋的大麻二酚（CBD）复合纳米颗粒可有效抵抗胃蛋白酶的消化，保持较低的CBD 释放。纳米颗粒在SIF 环境中HCF 的释放率明显增大，表明此时纳米颗粒运载体系破裂，HCF 快速游离出来，释放率增大。原因为肠部模拟环境的pH 为7.2，在此条件下复合纳米颗粒易被胰蛋白酶消化而释放HCF，实现人体结肠部位的靶向释放 。模拟胃肠液（SGF+SIF）消化240 min 时，复合纳米颗粒的HCF释放率达到75.66%，游离HCF 仅检出40.09%。因为复合纳米颗粒基质可以抵挡酶对HCF 的部分分解作用，同时Zein 因胰蛋白酶水解生成的多肽链可以与HCF 发生结合，有利于保护HCF 在消化过程中的降解 。
采用零级释放方程〔 Mt = kt + b ，其中， Mt 为单位时间（ t ）内HCF 释放率，%，下同； k 为零级释放常数，%/min； t 为释放时间，min，下同； b 为 t =0时的 Mt ，%〕、一级释放方程〔 Mt = b (1-e - kt )，其中， k 为一级释放速率常数，min -1 ； b 为 t =0 时的 Mt ，%〕、Higuchi 平面扩散（ Mt = kt 1/2 - b ，其中， k 为释放速率常数，min -1/2 ； b 为 t =0 时的 Mt ，%）以及Ritger-Peppas方程（ Mt = ktn ，其中， k 为释放速率常数，min - n ， n 为释放指数）分别对复合纳米颗粒在SGF 和SIF 120 min 内释放曲线进行拟合，结果如 表1 所示。由 表1 可知，复合纳米颗粒在SGF+SIF 中的释放趋势均符合Ritger-Peppas 模型， R 2 分别为0.983、0.997，优于其他模型。HCF 释放机制与Ritger-peppas 模型中的释放因子（ n ）有关，复合纳米颗粒SGF 中的释放因子0.45＜ n =0.521＜0.89，属于非Fick 扩散机制，说明HCF 在SGF 中的释放是在扩散以及纳米颗粒溶蚀二者共同作用下进行的。复合纳米颗粒SIF 中的释放因子 n =0.429＜0.45，属于Fick 扩散机制，说明颗粒内外浓度差是影响HCF 在SIF 中释放的主因，当纳米颗粒溶解时，HCF 的释放受控于基质溶蚀与扩散渗透机制。主要包括纳米颗粒表面的HCF 的释放扩散、颗粒内外浓度差不同引起的以渗透压为驱动力的扩散；此外，消化液渗入纳米颗粒内部引起高分子材料膨胀，分子链松弛，骨架逐渐松散，纳米颗粒发生溶胀破裂，HCF 受到扩散及溶胀的作用从内部向外转移；纳米颗粒溶解后，随着Zein 保护层的溶解，与Zein 内部结构紧密结合的HCF 逐渐被释放。
表1 HCF 在模拟胃肠液中的释放机制
3 结论
采用反溶剂法，以Zein 和HCF 为原料，成功制备了负载HCF 的Zein/HCF 复合纳米颗粒。考察了不同Zein 和HCF 质量比对Zein/HCF 复合纳米颗粒形貌、结构、粒径、Zeta 电位、包封率的影响。FTIR、XRD 结果表明，Zein 与HCF 间存在静电相互作用、氢键作用和疏水相互作用；DSC 曲线表明，加入HCF 后，Zein/HCF 复合纳米颗粒熔融温度增加，热稳定性提高；Zein/HCF 复合纳米颗粒平均粒径在150～300 nm 之间，PDI 均在0.2 以内，粒径分布均呈单峰分布，Zeta 电位均为负值。随着HCF 用量的增加，Zein/HCF 复合纳米颗粒平均粒径、PDI先减小后增大，Zeta 电位绝对值、包封率先增大后减小。 m (Zein)∶ m (HCF)=20∶3 复合纳米颗粒平均粒径、PDI 最小、粒径分布最窄，Zeta 电位绝对值及包封率最大，呈均匀性、分散性较好的圆球状。HCF 的加入使复合纳米颗粒具有较高的DPPH·、ABTS + ·清除能力。与游离 HCF 相比， m (Zein)∶ m (HCF)=20∶3 复合纳米颗粒具有较好的热处理保护能力，提高了HCF 的加热稳定性，经SGF 消化120 min 后HCF 释放率仅为22.31%，模拟胃肠液（SGF+SIF）消化240 min 时，HCF 释放率达到75.66%。缓释动力学模型拟合结果表明，HCF 在SGF+SIF 中的释放趋势均符合Ritger-Peppas 模型，但释放机制不同，SGF 中属于非Fick 扩散机制，说明HCF 释放是在扩散以及纳米颗粒溶蚀二者共同作用下进行的；而在SIF 中属于Fick 扩散机制，说明颗粒内外的浓度差是影响HCF 释放的主因。本研究开发的复合纳米颗粒在功能性食品和制药行业中作为HCF 或营养药品的输送载体具有很好的潜力，同时为黄酮类化合物与植物源性蛋白质之间的相互作用提供了一定的理论依据。
