CS-PAA/Zn2+复合网络水凝胶的制备与性能

金泽天; 程青; 毛黎; 罗立新; jinzetian; CHENG Qing; MAO Li; LUO Lixin

摘要

以壳聚糖（CS）和丙烯酸（AA）为原料、Zn为配位离子，采用紫外光照射法制备了CS-聚丙烯酸（PAA）/Zn复合网络水凝胶。通过FTIR、XRD、SEM 对样品进行了表征，考察了AA 与CS 上的氨基（—NH）物质的量比、Zn溶液加入量对CS-PAA/Zn溶胀能力、拉伸性能、细胞毒性和抗菌性能的影响。结果表明，CS-PAA/Zn复合网络水凝胶是以CS 链为主链，—NH 为第一位点交联较短的PAA 短链，减少了PAA 的生成，形成第一网络；PAA 短链上的—COOH 为第二位点，利用Zn的动态金属配位作用，形成第二网络。CS-PAA/Zn复合网络水凝胶存在较均匀、平整的外侧结构和富有管道空间及孔隙的内部结构；当使用1.0 g CS为原料、n(AA)∶n(—NH)＝1.0∶1、0.01 mol/L 的Zn溶液加入量为4.0 mL 时，制备的CS-PAA/Zn复合网络水凝胶溶胀能力和拉伸能力最强，在pH=1 的溶液中，最大溶胀度为87.2%，断裂伸长率为331.265%，同时保持了较好的细胞（MDA-MB-231 细胞）活性与抗菌（大肠杆菌）性能，其细胞毒性低，细胞增殖率最低可达327.9%，具有良好的抗菌性能，添加Zn后抑菌圈直径最大可达5 mm。

关键词: 壳聚糖水凝胶复合网络伤口敷料低毒性功能材料

壳聚糖（CS）是由甲壳素脱除 N -乙酰基得到的产物 ^[1] ，具有优异的生物可降解性 ^[2] 、生物相容性 ^[3-5] 和止血性能 ^[6] ，被广泛应用于生物医药的多种产业中 ^[7] ，例如：水凝胶敷料 ^[8] 、生物传感器 ^[9] 、人造骨骼 ^[10-11] 、细胞培养基 ^[12] 等，在其他行业也具有很大的应用潜力 ^[13] 。水凝胶是呈固体形态的三维聚合物网络 ^[14-15] 。当前，壳聚糖水凝胶的合成方法主要是自由基聚合法，其中，以光引发聚合 ^[16] 和添加交联剂的一锅法合成为主 ^[17] 。然而，添加交联剂的合成方法不可避免地会造成化学药剂的残留 ^[18-19] ，导致水凝胶对皮肤刺激性和细胞毒性的上升。而通过光引发聚合的方法不需要额外添加交联剂，在制备生物材料方面具有优势 ^[20-21] 。

ZHOU 等 ^[22] 通过壳聚糖与甲基丙烯酸乙二醇酯的Michael 加成反应制备了水溶性(甲基丙烯酰氧基)乙基羧乙基壳聚糖光交联大分子单体，将其用于制作组织工程支架。LIU 等 ^[23] 利用生物相容性光交联壳聚糖水凝胶膜，开发了一种甲硝唑控释葡萄糖敏感给药系统。在以往对CS-聚丙烯酸（PAA）水凝胶的研究中，研究人员使用大量的丙烯酸（AA） ^[24] 或以添加交联剂的方法 ^[25] 来保证水凝胶的物理性能，大量丙烯酸的添加会使壳聚糖本身卓越的生物相容性受限，水凝胶的性能极大地偏向聚丙烯酸为主体的单网络凝胶；而交联剂的使用会提高水凝胶的毒性，使其在伤口敷料上的应用受限。

本文拟通过紫外光自由基聚合的方法，制备以CS-PAA 网络为第一网络，PAA-Zn ²⁺ 络合网络为第二网络的低毒性复合网络水凝胶CS-PAA/Zn ²⁺ 。在聚合过程中，为避免聚丙烯酸单体的残留，降低水凝胶作为伤口敷料对皮肤的刺激性，采用尽可能少量的丙烯酸为原料来控制聚丙烯酸链的链长；引入具有杀菌作用的Zn ²⁺ 作为配位离子，利用动态金属配位作用来增强凝胶的物理特性，同时赋予其潜在的自愈合能力；并且，使用浸泡法制备脱水凝胶，可以有效增强凝胶的物理强度，获得可应用于伤口敷料领域的低毒性复合网络水凝胶，以期拓宽CS-PAA水凝胶的应用途径。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

CS（数均相对分子质量 50000，脱乙酰度＞70%）、丙烯酸，分析纯，天津市华东试剂厂；ZnSO ₄ ·7H ₂ O，化学纯，天津市化学试剂三厂；2-异丙基硫杂蒽酮（ITX），分析纯，巴斯夫化工有限公司；磷酸盐缓冲液（PBS，pH=6）；L-15 培养基、MDA-MB-231 细胞、增强型细胞活力检测试剂盒（CCK-8），普诺赛生命科技有限公司；LB 肉汤培养基、琼脂粉、大肠杆菌固体培养基、大肠杆菌（编号：ATCC25922），生工生物工程（上海）股份有限公司。

Instron 5967 型万能试验机，英国Instron 公司；Nicolet iS5 型傅里叶变换红外光谱仪（FTIR），美国Thermo Fisher Scientific 公司；D8 Advance 型X 射线衍射仪（XRD），德国Bruker 公司；FEI QUANTA FEG250 型场发射扫描电子显微镜（SEM），美国FEI公司；550 型ELSA 平板读取器，德国ELSA 科技公司。

1.2 样品的制备

将1.0 g CS 加入到40 mL 质量浓度为1.1 g/mL 的丙烯酸水溶液中，丙烯酸与壳聚糖上的氨基（—NH ₂ ）物质的量比为1.0∶1。磁力搅拌3 h，盖上保鲜膜放置3 h 至均匀澄清。预先滴入4.0 mL 浓度0.01 mol/L 的Zn ²⁺ 溶液（由ZnSO ₄ ·7H ₂ O 配制），搅拌均匀后，滴入0.4 mL 0.786 mol/L 的光引发剂ITX 甲醇溶液，边滴边搅拌，得到乳白色的黏稠液体。以4000 r/min 转速离心去除气泡，得到预聚溶液。

水凝胶样品的制备：将预聚溶液放入样品管中，紫外灯（365 nm，1 kW）下光照15 min，得到以CS-PAA 网络为第一网络，PAA-Zn ²⁺ 络合网络为第二网络的低毒性复合网络水凝胶CS-PAA/Zn ²⁺ 。其合成路线如下所示：

固定丙烯酸水溶液体积为40 mL，保持0.01 mol/L Zn ²⁺ 溶液加入量4.0 mL，调整丙烯酸与1.0 g CS 上的氨基物质的量比为0.5∶1、1.5∶1、2.0∶1，其他条件不变，得到不同 n (AA)∶ n (—NH ₂ )的CS-PAA/Zn ²⁺ 复合网络水凝胶；固定丙烯酸水溶液体积为40 mL，保持丙烯酸与1.0 g 壳聚糖上的氨基物质的量比为1.0∶1，调整滴入的浓度为0.01 mol/L 的Zn ²⁺ 溶液1.0、2.0、3.0、5.0、6.0 mL，其他条件不变，得到不同Zn ²⁺ 溶液加入量的CS-PAA/Zn ²⁺ 复合网络水凝胶。

固定丙烯酸水溶液体积为40 mL，未加入0.01 mol/L Zn ²⁺ 溶液，保持丙烯酸与1.0 g 壳聚糖上的氨基物质的量比为1.0∶1，制备得到CS-PAA 水凝胶。

如无特殊说明，后文表征和测试中，CS-PAA/Zn ²⁺ 复合网络水凝胶指的是在 n (AA)∶ n (—NH ₂ )=1.0∶1、Zn ²⁺ 溶液加入量为4.0 mL 条件下制备的样品。

1.3 表征方法与性能测试

将水凝胶样品放入-20 ℃冰箱冷冻12 h 后，再在-50 ℃真空冻干48 h 进行FTIR、XRD、SEM、溶胀能力测试。

1.3.1 FTIR 测试

分别取1 mg 干燥的CS、冻干的CS- PAA 水凝胶和CS-PAA/Zn ²⁺ 复合网络水凝胶，在红外灯下与100 mg 干燥的KBr 充分研磨，然后将研磨好的粉末转移到洁净的压片磨具中制片，最后将制作的晶片进行FTIR 检测，波数范围4000～500 cm ^-1 。

1.3.2 XRD 测试

分别取适量干燥的CS、冻干CS-PAA 水凝胶和冻干CS-PAA/Zn ²⁺ 复合网络水凝胶样品平铺在玻璃片上，置于XRD 内样品台上，待仪器稳定后扫描测试。测试条件为：Cu 靶K _α 射线，管电压45 kV，管电流200 mA，扫描速率8 (°)/min，扫描范围2 θ =5°～80°。

1.3.3 SEM 测试

用干净的药勺在冻干水凝胶表面及内部刮下碎末，均匀分散在导电胶上，表面喷Pt，通过SEM 观察记录样品形貌。

1.3.4 溶胀能力测试

在培养皿中倒入适量0.1 mol/L 的PBS，用0.1 mol/L 的盐酸调节pH 为1。切取大小合适、质量为 m _a （g）的冻干水凝胶放入培养皿溶液中，保证完全浸没。每5 min 取出，擦去表面水溶液，称量，记为 m _b （g），重复操作直至溶胀平衡3 次。每组实验重复3 次，取平均值。根据式（1）计算最大溶胀度（SR _max ）：

重复上述实验，其他条件不变，分别用0.1 mol/L的NaOH 溶液或0.1 mol/L 盐酸调节PBS 缓冲液至pH 分别为3、5、7、9、11，计算不同pH 溶液浸泡的水凝胶的SR _max 。

1.3.5 拉伸能力测试

将水凝胶样品在去离子水中浸泡72 h，期间每隔24 h 换1 次水。利用凝胶内部和外部的极性差异排出凝胶内的水分，使凝胶收缩成白色橡胶条状，得到脱水收缩的水凝胶样品。使用带有500 N 负荷传感器的万能试验机对样品进行了机械测试，拉伸速率为10 mm/min。实验重复5 次。

1.3.6 细胞毒性测试

将水凝胶样品按100 μL/孔铺于96 孔板，加入等量L-15 培养12 h，弃掉上清液，将MDA-MB-231细胞接种于凝胶表面，细胞密度5×10 ⁴ 个/mL，培养24 h。随后加入10 μL CCK-8，培养2 h。在ELSA平板读取器中用分光光度法（450 nm 波长）测量光密度（OD）。设置生理盐水为对照组，根据式（2）计算细胞增殖率（%）：

1.3.7 抗菌性能测试

采用抑菌圈法测试样品的抗菌性能。

称取2.5 g LB 肉汤培养基和100 mL 蒸馏水，在250 mL 试剂瓶中混合配制LB 液体培养基。重复上述操作，在LB 液体培养基中加入1.5 g 琼脂粉，配制LB 固体培养基。将LB 液体培养基和LB 固体培养基于高温高压蒸汽灭菌锅中121 ℃、15 min 灭菌后待用。待LB 液体培养基冷却至40～50 ℃，用电动移液器吸取15 mL 到一次性无菌平皿中。取两支12 mL 细菌培养管，各加入3 mL LB 液体培养基，从大肠杆菌固体培养基上挑取单菌落加入其中一支细菌培养管中，另一支作为空白对照。将两支细菌培养管放于恒温振荡器（37 ℃, 200 r/min）中振荡培养15 h，得到细菌悬液备用。取不同0.01 mol/L Zn ²⁺ 溶液加入量（分别为0、2.0、4.0 和6.0 mL）的CS-PAA/Zn ²⁺ 复合网络水凝胶，切成大小合适的小块，紫外灭菌30 min 备用。用无菌PBS 将制得的大肠杆菌悬液稀释至1×10 ⁵ CFU/mL，然后吸取100 μL均匀涂布于LB 固体培养基上，用10 mm 打孔器打孔，取紫外灭菌完成的样品分别加至孔内，将添加大肠杆菌悬液和凝胶样品的LB 固体培养基放于恒温培养箱中37 ℃培养24 h。培养完成后取出，用普通相机拍照并测量记录抑菌圈大小，每组取3 个样品，结果取平均值。

2 结果与讨论

2.1 溶胀能力分析

水凝胶的溶胀能力对其在伤口敷料领域上的应用至关重要，其影响着水凝胶对伤口渗出液的吸收能力。图1 为pH 对不同 n (AA)∶ n (—NH ₂ )制备的CS-PAA/Zn ²⁺ 复合网络水凝胶最大溶胀度的影响。

图1 pH 对不同

从图1 可以看出，随着pH 的增大，所有CS-PAA/Zn ²⁺ 复合网络水凝胶的SR _max 均呈现减小并逐渐平稳或小幅回升的趋势，说明CS-PAA/Zn ²⁺ 复合网络水凝胶在酸性条件下具有较好的吸水能力。原因可能是，强酸条件下壳聚糖的游离氨基电离程度高，电荷斥力使凝胶内部空间增大，增强了吸水能力。随着pH 的升高，氨基电离程度降低，凝胶内部空间减小，溶胀能力减弱。而随着pH 的继续升高至碱性，羧基的电离程度增加，由于渗透压和电荷斥力的原因，凝胶溶胀能力回升。从图1 还可以看出， n (AA)∶ n (—NH ₂ )=1.0∶1 时，制备的CS-PAA/Zn ²⁺ 复合网络水凝胶具有最强的溶胀能力（pH=1 时，SR _max =87.2%）。原因可能是， n (AA)∶ n (—NH ₂ )=1.0∶1 时，丙烯酸的用量足够使壳聚糖链交联，凝胶结构稳定，具有较好的保水能力。而当 n (AA)∶ n (—NH ₂ )增大时，丙烯酸用量的增加导致凝胶内部的羧基数量增加，过多的亲水羧基排列在凝胶外侧，疏水氨基在内侧，内外的极性差异使凝胶的吸水能力减弱。

2.2 拉伸性能分析

作为伤口敷料，水凝胶的拉伸能力也很重要，因为人体运动时会对敷料产生拉扯使其伸长延展，而较好的拉伸能力能够保证其在被拉扯时不会断裂。图2 为CS-PAA 水凝胶和Zn ²⁺ 溶液加入量为2.0、4.0 和6.0 mL 制备的CS-PAA/Zn ²⁺ 复合网络水凝胶的拉伸性能。

图2 CS-PAA 和不同Zn

从图2 可以看出，没有加入Zn ²⁺ 制备的CS-PAA水凝胶，断裂伸长率为106.228%，拉伸应力为0.045 MPa。随着Zn ²⁺ 溶液加入量的增加，CS-PAA/Zn ²⁺ 复合网络水凝胶断裂伸长率先升后降；当Zn ²⁺ 溶液加入量为 4.0 mL 时，断裂伸长率达到峰值，为331.265%；当Zn ²⁺ 溶液加入量增至6.0 mL 时，断裂伸长率降低至218.746%；而拉伸应力随着Zn ²⁺ 溶液加入量的增加而上升，最高达到0.129 MPa（Zn ²⁺ 溶液加入量为6.0 mL）。另外，从引入Zn ²⁺ 后的应力-应变曲线能观察到较为明显的“屈服成颈”现象，此现象说明，Zn ²⁺ 的加入在凝胶内部形成了第二种交联形式。其原因可能是，加入的Zn ²⁺ 和游离的羧基形成配位，使羧基成为第二交联位点，加强了凝胶的网状结构，进而增强了凝胶拉伸性能；而加入过量的Zn ²⁺ 后影响了自由基的聚合，使凝胶整体分子量降低 ^[25] ，导致拉伸能力下降。总之，Zn ²⁺ 的加入使凝胶的拉伸性能得到了极大的加强，这归功于Zn ²⁺ 的动态金属配位作用。

2.3 FTIR 分析

图3 为CS、CS-PAA、CS-PAA/Zn ²⁺ 的FTIR 谱图。

图3 CS、CS-PAA 和CS-PAA/Zn

从图3 可以看出，CS 在3500～3250 cm ^-1 处的吸收峰为—OH、—NH ₂ 的伸缩振动，而 CS-PAA 和CS-PAA/Zn ²⁺ 上此处的吸收峰明显减弱，原因是聚合后凝胶内部的氢键作用被大幅削弱；CS-PAA 在1750 cm ^-1 处的吸收峰归属于丙烯酸中的C==O 键的伸缩振动，CS 在此处不存在吸收，而CS-PAA/Zn ²⁺ 在此处的峰透过率明显减弱，说明Zn ²⁺ 的引入消耗了凝胶内部的羧基，与Zn ²⁺ 形成了配位；CS 中1640 cm ^-1 处的吸收峰为N—H 键的伸缩振动，而CS-PAA 和CS-PAA/Zn ²⁺ 中N—H 键的伸缩振动红移至1618 cm ^-1 ，且峰透过率明显减弱。 CS-PAA 和CS-PAA/Zn ²⁺ 在1450 cm ^-1 处C—N 键的吸收峰透过率比CS 强，这两处峰值的变化说明水凝胶内部的氢键作用被削弱，PAA 与CS 的结合位点在CS 中的—NH ₂ 上。1050 和1250 cm ^-1 两处的吸收峰归属于C—O—C 键的伸缩振动，3 种样品在此处均有吸收，且透过率无明显变化，说明聚合反应发生后CS链没有断裂，可以保持较大的相对分子质量。综上所述，CS 和PAA 成功通过离子相互作用力结合形成水凝胶，引入的Zn ²⁺ 与羧基形成配位，成功制备了CS-PAA/Zn ²⁺ 复合网络水凝胶。

2.4 XRD 分析

图4 为CS、CS-PAA、CS-PAA/Zn ²⁺ 的XRD 谱图。

图4 CS、CS-PAA、CS-PAA/Zn

从图4 可以看出，所有样品在2 θ =22°左右存在宽且钝的峰，说明所有样品都是无定形的，随着Zn ²⁺ 的引入，此峰强度减弱，且峰变宽，说明Zn ²⁺ 的加入降低了凝胶的结晶度，同时减弱了凝胶内部氢键的强度。这与FTIR 表征结果相互印证，证明Zn ²⁺ 确实参与了CS-PAA 水凝胶的交联，形成了以羧基和Zn ²⁺ 之间的配位键为主的交联网络，进而使凝胶内部的交联形式复杂化，结晶度降低。

2.5 SEM 分析

图5 为CS-PAA/Zn ²⁺ 复合网络水凝胶在SEM 观察下外表面与斜截面的形貌。

图5 CS-PAA/Zn

从图5 可以看出，CS-PAA/Zn ²⁺ 复合网络水凝胶具有较为平整且具有小孔隙的外层结构（图5 a），这归因于CS-PAA/Zn ²⁺ 复合网络水凝胶外层的亲水性。CS-PAA/Zn ²⁺ 复合网络水凝胶内部具有大量的管道，斜截面呈现复杂的多孔形貌（图5 b～d）。造成内外部形貌不同的原因来自于凝胶内外侧的极性差异，亲水性强的外侧形成均匀的凝胶壁，而内侧由于亲水性较弱，聚合时留在内部的水分在凝胶内侧蓄出较大的管道空间。与CS-PAA 水凝胶相比 ^[24] ，CS-PAA/Zn ²⁺ 复合网络水凝胶存在较为均匀平整的外侧结构，可以隔绝外部细菌；而富有管道空间及孔隙的内部结构可以吸收大量体液，适合作为水凝胶伤口敷料。

2.6 细胞毒性分析

图6 为不同Zn ²⁺ 溶液加入量制备的CS-PAA/Zn ²⁺ 复合网络水凝胶细胞毒性测试结果。

图6 不同Zn

从图6 可以看出，与对照组相比，CS-PAA 水凝胶对细胞增殖有明显的促进作用，细胞增殖率达到509.0%；而随着Zn ²⁺ 溶液加入量的增加，细胞增殖率先降低后上升，当Zn ²⁺ 溶液加入量为4.0 mL 时制备的CS-PAA/Zn ²⁺ 复合网络水凝胶对细胞增殖的抑制能力最强，细胞增殖率最低，为327.9%。这是因为，逐渐升高的Zn ²⁺ 含量引发细胞线粒体损伤，导致细胞增殖率处于较低水平 ^[26] 。但与对照组相比，CS-PAA/Zn ²⁺ 复合网络水凝胶仍然显示出较高的细胞增殖率，细胞毒性低，表明CS-PAA/Zn ²⁺ 复合网络水凝胶对伤口愈合有促进作用。

2.7 抗菌性能分析

图7 和表1 为CS-PAA 和3 种CS-PAA/Zn ²⁺ 大肠杆菌的抗菌性能测试结果。

表1 水凝胶抗菌性能测试数据

图7 CS-PAA 和不同CS-PAA/Zn

从图7 与表1 可以看出，CS-PAA 水凝胶具有一定的抗菌能力，但无法完全抑制大肠杆菌的生长，没有形成清晰、完整的抑菌圈；当引入Zn ²⁺ 后，CS-PAA/Zn ²⁺ 复合网络水凝胶具备了较好的抗菌效果，形成了清晰明显的抑菌圈，且抑菌圈直径随着Zn ²⁺ 水溶液加入量的增多而逐渐增大，最大可达5 mm。这主要归功于Zn ²⁺ 的抑菌能力。这表明CSPAA/Zn ²⁺ 复合网络水凝胶具有一定的抗菌能力，可以作为防止伤口细菌感染的材料进一步研究。

与以往研究 ^[27] 相比，本文制备CS-PAA/Zn ²⁺ 复合网络水凝胶减少了90%以上的丙烯酸用量，发挥壳聚糖水凝胶可降解性与生物相容性的优点，避免了化学交联剂的使用，降低了水凝胶的细胞毒性和皮肤刺激性。

3 结论

（1）通过紫外光射法在常温下成功制备了CS-PAA/Zn ²⁺ 复合网络水凝胶。

（2）1.0 g 壳聚糖、 n (AA)∶ n (—NH ₂ )=1.0∶1、0.01 mol/L 的Zn ²⁺ 溶液加入量为4.0 mL 制备的CS-PAA/Zn ²⁺ 复合网络水凝胶溶胀能力和拉伸能力最强，在pH=1 的溶液中，最大溶胀度87.2%，断裂伸长率331.265%，同时保持了较好的细胞（MDAMB-231 细胞）活性与抗菌（大肠杆菌）性能。

（3）制备CS-PAA/Zn ²⁺ 复合网络水凝胶减少了90%以上的丙烯酸用量，发挥壳聚糖水凝胶可降解性与生物相容性的优点，避免了化学交联剂的使用，降低了水凝胶的细胞毒性和皮肤刺激性。

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