DOI:10.13550/j.jxhg.20240769
中图分类号:TQ920.6;|O645.1
离子液体辅助植物乳杆菌发酵刺五加制备异嗪皮啶工艺优化
金爽， 赵华勇， 任裕斌， 彭彩亮， 刘维丽， 吕晨， 程玉鹏， 李慧玲
| 【作者机构】 | 黑龙江中医药大学药学院北药基础与应用研究省部共建重点实验室； 黑龙江中医药大学实验实训中心； 黑龙江中医药大学附属第一医院 |
| 【分 类 号】 | TQ920.6;O645.1 |
| 【基 金】 | 国家自然科学基金项目（82204776） 黑龙江省“春雁”支持计划青年英才项目（2022CYQN0028） 黑龙江省大学生创新创业训练计划项目（S202410228061） 黑龙江省博士后启动金项目（LBH-Q21184） 黑龙江省自然科学基金项目（LH2023B021） 黑龙江省省属本科高校中央支持地方高校改革发展资金优秀青年人才项目（2021ZYYQLG002） 黑龙江省教育厅基本业务项目（2022PT04） |
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离子液体辅助植物乳杆菌发酵刺五加制备异嗪皮啶工艺优化
刺五加为五加科植物刺五加〔Eleutherococcus senticosus (Rupr. et Maxim.) Maxim.〕的干燥根或茎，又名五加参、刺拐棒，作为传统中药材应用已久。刺五加活性成分主要有氨基酸类、微量元素、糖类、木脂素类、香豆素类、黄酮类等，具有益气健脾、补肾安神的功效，用于脾肺气虚、体虚乏力、食欲不振、心脾不足、失眠多梦等[1]。现有刺五加的相关制剂以刺五加注射液与提取物为主[2]，临床主要用于治疗肝肾不足所致的短暂性脑缺血疾病，也用于治疗冠心病、心绞痛合并神经衰弱和更年期综合症等[3]。刺五加作为东北地区的道地药材，更有“寒地龙药之首”的美称[4]，具有较高的产量。然而，刺五加的天然异嗪皮啶含量较低，长期以来，其资源未能得到充分合理的开发与利用[5]。
异嗪皮啶是一种存在于多种植物中的香豆素类化合物。高纯度的异嗪皮啶为白色结晶粉末，易溶于甲醇、乙醇、氢氧化钠溶液，难溶于冷水。异嗪皮啶作为中药刺五加的主要活性成分之一[6]，具有镇静催眠[7]、抗炎[8]、抗氧化[9]等功效，但在刺五加中的含量很低，大部分以结合的糖苷形式存在，即刺五加苷B1，可通过α-葡萄糖苷酶转化为异嗪皮啶，如下所示。
为避免中药资源的浪费，现阶段多采取酸碱水解法、生物转化法、多聚体转化法等方法转化合成异嗪皮啶。其中，酸碱水解法的设备损耗大、反应剧烈，对生态环境造成一定的损害；生物转化法又可分为酶促转化法和微生物发酵转化法，前者具有反应特异性强、条件温和、操作简便、环保安全等优点，可定向转化中药原料，提升目标产物的纯度和活性成分含量[10]。然而，由于酶的制备和纯化过程复杂且昂贵，导致其成本较高。此外，酶的活性和稳定性易受环境条件影响，需精确控制，且酶促转化法通常仅适用于特定底物，处理复杂混合物的能力有限。相比之下，微生物发酵转化法能够在更宽松的条件下高效处理复杂混合物[11]。通过微生物自繁殖提供所需酶类，避免了昂贵的酶制备，并且能够实现多步骤转化，提高产物得率和生产效率，适合大规模工业化生产。管立军等[12]成功使用植物乳杆菌发酵提高了异嗪皮啶含量。然而，微生物发酵也存在产物收率不稳定、转化效率受限等问题。离子液体（IL）在室温下以液体形式存在，是由一种无机阴离子和有机阳离子或有机阴离子和有机阳离子组成的，具有不对称取代基的有机盐类物质。离子液体具有蒸汽压不显著、热稳定性好[13]、理化性质可调、毒性作用低甚至无毒等优良特性[14]，可作为传统挥发性有机溶剂的优良替代品，作为催化剂辅助酶促反应和全细胞生物转化[15-16]。离子液体通过增强微生物对底物的利用率，提高发酵效率，缩短生产时间，从而有效弥补传统发酵法的缺陷。洪立伟等[17]研究表明，离子液体可以显著改善微生物的生物转化，保证酶良好的活性，增强酶的稳定性，使底物和酶充分接触，解除底物竞争抑制，大幅提高产物的收率。
本文拟以刺五加为原料，通过离子液体辅助发酵菌进行生物转化，优化刺五加的最佳生物转化条件，考察离子液体辅助发酵菌转化过程中异嗪皮啶含量的变化，提升其产量，以期为异嗪皮啶的规模化生产和食品工业应用提供可行策略。
1 实验部分
1.1 材料、试剂与仪器
植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum CICC20767）、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus CICC6082）、干酪乳杆菌（Lacticaseibacillus paracasei CICC20280）、乳酸杆菌（Levilactobacillus brevis CICC23470），黑龙江微生物研究所提供；刺五加，产地黑龙江，黑龙江哈尔滨同仁堂提供。
MRS 培养基，广东环凯微生物科技有限公司；乙腈、甲醇、磷酸，分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；1-乙基-3-甲基咪唑氯盐（[C2MIM]Cl）、1-乙基-3-甲基咪唑碘盐（[C2MIM]I）、1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐（[C2MIM]BF4）、1-乙基-3-甲基咪唑硫酸氢盐（[C2MIM]HS
）、1-乙基-3-甲基咪唑溴盐（[C2MIM]Br）、1-丁基-3-甲基咪唑溴盐（[C4MIM]Br）、1-己基-3-甲基咪唑溴盐（[C6MIM]Br）、1-辛基-3-甲基咪唑溴盐（[C8MIM]Br），上海成捷化学有限公司。
H2Q-F100 型振荡培养箱，哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；2500Y 型中药粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司；Ultimate 3000 型高效液相色谱仪（HPLC），美国Agilent 公司；PB-21 型pH 计，美国Sartorius 公司；Milli-Q 型超纯水系统，美国Millpore 公司；HVE-50 型自动电热压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂。
1.2 方法
1.2.1 异嗪皮啶的生物转化
将刺五加粉碎后烘干，过筛（65 目），得到刺五加粉末，经灭菌处理（121 ℃，20 min）后，置于4 ℃冰箱中保存备用。将刺五加粉末1.000 g 加入到含有0.4 mol/L 离子液体的MRS 培养基的锥形瓶中，消毒杀菌。然后，在MRS 培养基内活化好的菌中加入一定量的无菌水，制成1×107 CFU/mL 的菌悬液。最后，将500 μL 细菌悬液加入到锥形瓶中，在36 ℃、130 r/min 的条件下振荡培养24 h，进行发酵。
1.2.2 异嗪皮啶的超声提取
取发酵24 h 后的发酵产物，置于自动电热压力蒸汽灭菌器中高温（121 ℃）、高压（0.12 MPa）灭菌20 min，待自然冷却后，放入90 ℃恒温烘箱，干燥48 h。待完全干燥后，以体积分数80%的甲醇水溶液为提取溶剂，超声提取30 min，减压抽滤，过0.22 μm 滤膜，得到异嗪皮啶提取原液。
1.2.3 异嗪皮啶含量的测定
采用HPLC 测定异嗪皮啶提取原液中异嗪皮啶的含量。采用HPLC，Positisil® ODS-P 120A 色谱柱（4.6 mm×250 mm×5 μm），检测波长为343 nm，流动相为体积比20∶80 的乙腈/质量分数0.1%磷酸溶液，柱温25 ℃，流速1 mL/min[18]。
称取异嗪皮啶，用甲醇定容，制成质量浓度为1 g/L 溶液，稀释得到不同质量浓度的溶液。过0.22 μm 滤膜后保存在1.5 mL 瓶中，平行进样3 次，测定峰面积，以异嗪皮啶的质量浓度（x，g/L）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标，建立线性回归方程，得到标准曲线的方程为：y=17123x+0.7136，R2=0.9998。
1.3 发酵菌种和离子液体的筛选
1.3.1 发酵菌种
采用1.2.2 节实验方法，考察嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌、乳酸杆菌发酵刺五加转化制备异嗪皮啶产量的差异，优选异嗪皮啶产量最高的发酵菌种。按照式（1）计算异嗪皮啶产量：
式中：Y 为异嗪皮啶产量，mg/g；ρ 为提取原液中异嗪皮啶质量浓度，g/L；V 为提取原液体积，mL；m为投入刺五加质量，g。
1.3.2 离子液体
在优选发酵菌种的基础上，采用1.2.2 节实验方法，考察1-乙基-3-甲基咪唑（C2MIM+）分别与5种不同阴离子（Cl-、Br-、I-、B
、HS
）制备的离子液体对刺五加转化制备异嗪皮啶产量的差异，优选制备离子液体最佳的阴离子类型。
在优选制备离子液体最佳的阴离子类型的基础上，采用1.2.2 节实验方法，考察系列1-烷基-3-甲基咪唑阳离子（C2MIM+、C4MIM+、C6MIM+和C8MIM+）制备的离子液体对刺五加转化制备异嗪皮啶产量的差异，优选制备离子液体最佳的阳离子类型。
1.4 异嗪皮啶生物转化制备单因素实验
1.4.1 pH 的影响
采用移液枪取500 μL 冲洗后的细菌悬液，加入到含5 g 无菌刺五加根粉和150 mL 含有0.6 mol/L离子液体的MRS 培养基的200 mL 锥形瓶中，保持液固比（mL∶g，下同）30∶1，以质量分数10%盐酸或1 mol/L 氢氧化钠水溶液调节pH（4.5、5.0、5.5、6.0、6.5），在36 ℃、130 r/min 的条件下振荡培养24 h，进行生物转化，考察不同pH 对异嗪皮啶产量的影响。
1.4.2 液固比的影响
采用移液枪取500 μL 冲洗后的细菌悬液，加入到含5 g 无菌刺五加根粉的200 mL 锥形瓶中，调节pH=6.0，加入不同体积含有0.6 mol/L 离子液体的MRS 培养基，使液固比（10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1），在36 ℃、130 r/min 的条件下振荡培养24 h，进行生物转化，考察不同的液固比对异嗪皮啶产量的影响。
1.4.3 发酵时间的影响
采用移液枪取500 μL 冲洗后的细菌悬液，加入到含5 g 无菌刺五加根粉和150 mL 含有0.6 mol/L离子液体的MRS 培养基的200 mL 锥形瓶中，保持液固比30∶1、pH=6.0，在36 ℃、130 r/min 的条件下振荡培养不同时间（12、24、36、48、60 h），进行生物转化，考察不同发酵时间对异嗪皮啶产量的影响。
1.4.4 发酵温度的影响
采用移液枪取500 μL 冲洗后的细菌悬液，加入到含5 g 无菌刺五加根粉和150 mL 含有0.6 mol/L离子液体的MRS 培养基的200 mL 锥形瓶中，保持pH=6.0，调节反应温度（35、36、37、38、39 ℃），在130 r/min 的条件下振荡培养24 h，进行生物转化，考察不同发酵温度对异嗪皮啶产量的影响。
1.4.5 离子液体浓度的影响
采用移液枪取500 μL 冲洗后的细菌悬液，加入到含5 g 无菌刺五加根粉和150 mL 含有不同浓度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L）的离子液体的MRS培养基的200 mL 锥形瓶中，在pH=6.0、36 ℃、130 r/min 的条件下振荡培养24 h，进行生物转化，考察离子液体不同浓度对异嗪皮啶产量的影响。
1.5 异嗪皮啶生物转化制备响应面实验
根据单因素实验结果，按照Box-Behnken Design（BBD）原理设计响应面实验，以pH（A）、发酵温度（B）、离子液体浓度（C）为自变量，以异嗪皮啶产量为响应值，对3 个因素分别设置3 个水平，用“-1、0、+1”表示，pH、发酵温度、离子液体浓度根据单因素研究结果中心点取值。
1.6 异嗪皮啶超声提取单因素实验
取发酵24 h 后的发酵产物，置于高压灭菌锅中高温（121 ℃）、高压（0.12 MPa）灭菌20 min，待自然冷却后，放入90 ℃恒温烘箱，干燥48 h，得干燥固形物，记为异嗪皮啶粗品。
1.6.1 甲醇浓度的影响
取异嗪皮啶粗品1 g，保持液固比（mL∶g）25∶1，分别以不同体积分数（60%、70%、80%、90%、100%）的甲醇水溶液为提取溶剂，在超声温度50 ℃的条件下，400 W 超声提取30 min，减压抽滤，过0.22 μm 滤膜，得到异嗪皮啶提取原液。
1.6.2 超声功率的影响
取异嗪皮啶粗品1 g，保持液固比25∶1，以体积分数80%的甲醇水溶液为提取溶剂，在超声温度50 ℃的条件下，不同超声功率（200、300、400、500、600 W）超声提取30 min，减压抽滤，过0.22 μm 滤膜，得到异嗪皮啶提取原液。
1.6.3 液固比的影响
取异嗪皮啶粗品1 g，以体积分数80%的甲醇水溶液为提取溶剂，使成不同液固比（5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1），在超声温度50 ℃的条件下，400 W 超声提取30 min，减压抽滤，过0.22 μm滤膜，得到异嗪皮啶提取原液。
1.6.4 超声时间的影响
取异嗪皮啶粗品1 g，以体积分数80%的甲醇水溶液为提取溶剂，在液固比为20∶1、超声温度50℃的条件下，400 W 超声提取（20、30、40、50、60 min），减压抽滤，过0.22 μm 滤膜，得到异嗪皮啶提取原液。
1.7 异嗪皮啶超声提取响应面实验
根据单因素实验结果，按照 Box-Behnken Design（BBD）原理设计响应面实验，以超声功率（A）、液固比（B）、超声时间（C）为自变量，以异嗪皮啶的提取量为响应值。对3 个因素分别设置3 个水平，用-1、0、+1 表示，超声功率、液固比、超声时间根据单因素研究结果中心点取值。
1.8 数据处理
数据进行统计分析，每组实验至少独立重复3次。结果以“算数平均值±标准差”形式表示，统计学显著性为P＜0.05。
2 结果与讨论
2.1 发酵菌种的筛选
图1 为发酵菌种对异嗪皮啶产量的影响。
图1 发酵菌种对异嗪皮啶产量的影响
Fig. 1 Effect of fermentation strains on yield of isofraxidin
从图1 可以看出，植物乳杆菌的发酵效果最佳，异嗪皮啶产量达到0.092 mg/g，是无发酵菌条件下异嗪皮啶产量（0.051 mg/g）的1.8 倍。相比之下，嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌在相同条件下的发酵效果较差。可能的原因是，植物乳杆菌所含的复杂酶系中富含α-葡萄糖苷酶[19]，这种关键酶能显著提高刺五加苷B1 生物转化制备异嗪皮啶的效率。因此，优选植物乳杆菌为最佳发酵菌种。
2.2 离子液体种类的筛选
图2a 为不同阴离子组成的1-乙基-3-甲基咪唑离子液体对异嗪皮啶产量的影响。
图2 不同阴离子（a）和阳离子（b）的离子液体对异嗪皮啶产量的影响
Fig. 2 Effects of ionic liquids with different anions (a) and cations (b) on yield of isofraxidin
从图2a 可以看出，不同阴离子类型的1-乙基-3-甲基咪唑离子液体的异嗪皮啶产量具有显著差异。其中，Br-为阴离子的离子液体[C2MIM]Br，其异嗪皮啶产量（0.101 mg/g）显著高于其他阴离子（Cl-、I-、B
、HS
）的离子液体。[C2MIM]I 效果较差的原因可能在于I-具有较强的氧化性，导致离子液体具有毒性；而[C2MIM]BF4 低效可能与其在生物转化过程中生成HF，导致发酵菌群失活有关[20]。而[C2MIM]Br与化合物之间存在更强的多重相互作用，包括π-π 相互作用、离子/电荷相互作用以及氢键作用[21]。
图2b 为不同阳离子组成的1-烷基-3-甲基咪唑离子液体对异嗪皮啶产量的影响。
从图2b 可以看出，随着烷基链长的增加，异嗪皮啶产量先增加后减小。离子液体[C4MIM]Br 的异嗪皮啶产量最高，为0.162 mg/g。这是因为，与具有更长烷基链的离子液体[C6MIM]Br 和[C8MIM]Br相比，[C4MIM]Br 对植物乳杆菌的影响相对温和。RANKE 等[22]研究表明，烷基链长与离子液体的毒性呈正相关，可能的机理是离子液体对发酵菌种具有静电吸附作用，烷基链部分插入细胞膜中，破坏细胞质的稳定性。因此，优选[C4MIM]Br 为最佳离子液体。
2.3 异嗪皮啶生物转化制备单因素实验分析
2.3.1 pH 的影响
图3a 为pH 对异嗪皮啶产量的影响。
图3 不同因素对异嗪皮啶生物转化的影响
Fig. 3 Effects of different factors on biotransformation of isofraxidin
从图3a 可以看出，随着pH 的增加，异嗪皮啶产量呈先增加后减小的趋势。当pH=6.0 时，异嗪皮啶产量最大，为0.235 mg/g。这是因为，pH 较低或较高时，酸碱性会抑制酶的活性及改变酶的构象，进而影响植物乳杆菌活力[23]，降低异嗪皮啶产量。因此，优选最佳pH=6.0。
2.3.2 液固比的影响
图3b 为液固比对异嗪皮啶产量的影响。
从图3b 可以看出，随着液固比的增加，异嗪皮啶产量呈先增加后减小的趋势。当液固比为25∶1时，异嗪皮啶产量最大，为0.225 mg/g。这是因为，离子液体用量的增加可以为菌株提供足够的氧气，产生更多的酶促进发酵。但过高的液固比会导致底物相对浓度下降，抑制反应进程。因此，优选最佳液固比为25∶1。
2.3.3 发酵时间的影响
图3c 为发酵时间对异嗪皮啶产量的影响。
从图3c 可以看出，随着发酵时间的增加，异嗪皮啶产量呈先增加后减小的趋势。当发酵时间为36 h时，异嗪皮啶产量最高，为0.216 mg/g。可能因为，前期充足底物增加了苷元转化速率，后期菌株中复杂酶系流出导致异嗪皮啶分解，产量降低。因此，优选最佳发酵时间为36 h。
2.3.4 发酵温度的影响
图3d 为发酵温度对异嗪皮啶产量的影响。
从图3d 可以看出，随着发酵温度的升高，异嗪皮啶产量呈先增加后减小的趋势。当发酵温度为37 ℃时，异嗪皮啶产量最大，为0.278 mg/g。这是因为，在酶的适宜温度内提高温度，会提升生物转化效率，若超出适宜温度继续提高温度，会抑制酶的活性。因此，优选最佳发酵温度为37 ℃。
2.3.5 离子液体浓度的影响
图3e 为离子液体[C4MIM]Br 浓度对异嗪皮啶产量的影响。
从图3e 可以看出，随着[C4MIM]Br 浓度的增加，异嗪皮啶产量呈先增加后减小的趋势。当[C4MIM]Br 浓度为0.6 mol/L 时，异嗪皮啶产量最大，为0.236 mg/g。这是因为，当离子液体浓度过低时，会对无需生物酶催化协助的化学水解反应速率造成影响，当离子浓度过高时，会降低传质速率，降低生物转化效率。因此，优选[C4MIM]Br 浓度为0.6 mol/L。
2.4 异嗪皮啶生物转化制备响应面实验
2.4.1 响应面实验结果
采用Design Expert 13.0 软件对表1 中的数据进行二项式拟合，并对模型进行方差分析，得到二项式拟合方程为 Y=0.2548+0.0016A-0.0091B-0.0108C+0.0002AB+0.0110BC-0.0358A2-0.0163B2-0.0505C2（P＜0.01，R2=0.9955）。
表1 响应面实验编码值与实际值对照
Table 1 Response surface experiment coded values vs.actual values
编码值 实际值序号A B CpH发酵温度/℃离子液体浓度/(mol/L)Y/(mg/g)1 -1 0 1 5.537 0.8 0.156 2 0 1 -1 6.038 0.4 0.179 3 0 0 0 6.037 0.6 0.249 4 0 -1 1 6.036 0.8 0.175 5 1 0 1 6.537 0.8 0.159 6 -1 0 -1 5.537 0.4 0.178 7 0 0 0 6.037 0.6 0.261 8 -1 1 0 5.538 0.6 0.191 9 -1 -1 0 5.536 0.6 0.211 101 1 0 6.538 0.6 0.195 110 -1 -1 6.036 0.4 0.218 121 -1 0 6.536 0.6 0.214 131 0 -1 6.537 0.4 0.181 140 0 0 6.037 0.6 0.258 150 0 0 6.037 0.6 0.254 160 0 0 6.037 0.6 0.252 170 1 1 6.038 0.8 0.180
2.4.2 模型拟合与方差分析
方差分析结果如表2 所示。从二次多项式拟合结果来看，模型P＜0.01，表明该拟合模型具有极显著性，失拟项P＞0.05，模型相关系数R2=0.9955，说明二次多项式方程模型对数据拟合度较高，误差小，模型可靠，可作为异嗪皮啶生物转化制备工艺的分析测试模型。一次项A（pH）影响不显著，B（发酵温度）、C（离子液体浓度）影响极显著，二次项A2、B2、C2 影响极显著，由此可知，各影响因素与异嗪皮啶产量之间并不是简单的线性关系。
表2 方差分析结果
Table 2 Results of variance analysis
注：“**”表示差异极显著（P＜0.01）；“*”表示差异显著（P＜0.05）；“○”表示差异不显著（P＞0.05）。下同。
变异来源 平方和自由度均方值 F 值 P 值 显著性模型 0.02109 0.0023 172.43 ＜0.0001**A pH 0 1 0 1.56 0.2513○B 发酵温度 0.00071 0.0007 49.32 0.0002＊＊C 离子液体浓度0.00091 0.0009 68.45 ＜0.0001＊＊AB 0 1 0 0.02 0.8956○AC 0 1 0 0 1.0000○BC 0.00051 0.0005 35.83 0.0005＊＊A2 0.00541 0.0054 398.96 ＜0.0001**B2 0.00111 0.0011 82.57 ＜0.0001**C2 0.01071 0.0107 795.77 ＜0.0001**残差 0.00017 0 —失拟项 0 3 0 0.06 0.9807○纯误差 0.00014 0 —总和 0.021116 —
2.4.3 响应面分析
采用Design Expert 13.0 软件绘制异嗪皮啶产量、pH、发酵温度、离子液体浓度之间的三维曲面图，结果如图4～6 所示。
图4 pH、发酵温度对异嗪皮啶产量的响应曲面及等高线图
Fig. 4 Response surface and contour plot of pH and fermentation temperature on yield of isofraxidin
图5 发酵温度、离子液体浓度对异嗪皮啶产量的响应曲面及等高线图
Fig. 5 Response surface and contour plot of fermentation temperature and ionic liquid concentration on yield of isofraxidin
图6 pH、离子液体浓度对异嗪皮啶产量的响应曲面及等高线图
Fig. 6 Response surface and contour plot of pH and ionic liquid concentration on yield of isofraxidin
由响应面图可得到优化条件为：pH=6.01、发酵温度36.67 ℃、离子液体浓度0.57 mol/L。
2.4.4 工艺验证结果
根据Design Expert 13.0 软件分析得到的优化条件pH=6.0、发酵温度36.5 ℃、离子液体浓度0.57 mol/L进行验证实验，结果如表3 所示。从表3 可以看出，异嗪皮啶产量为0.257 mg/g，与预测值之间的偏差为-0.20%，实验结果与预测值接近，说明该模型可靠，该优化条件是可行的。
表3 工艺验证结果
Table 3 Verification test results
实验次数1 2 3 平均值 预测值Y/(mg/g)0.2540.2590.258 0.257 0.263偏差/% -0.35 -0.10 -0.15
2.5 异嗪皮啶超声提取单因素实验
图7 为不同超声提取条件对异嗪皮啶产量的影响。
图7 不同超声提取条件对异嗪皮啶产量的影响
Fig. 7 Effect of different ultrasonic extraction conditions on yield of isofraxidin
2.5.1 提取剂体积分数的影响
图7a 为甲醇体积分数对异嗪皮啶产量的影响。
从图7a 可以看出，随着甲醇体积分数的增加，异嗪皮啶产量呈不断增加的趋势，甲醇体积分数为100%时提取效果达到最佳，异嗪皮啶产量为0.276 mg/g，可能的原因是受异嗪皮啶溶解度的限制，在非极性溶剂中异嗪皮啶具有更高的溶解度。因此，最佳甲醇体积分数为100%。
2.5.2 超声功率的影响
图7b 为超声功率对异嗪皮啶产量的影响。
从图7b 可以看出，随着超声功率的增加，异嗪皮啶产量呈先增加后降低的趋势，当超声功率在500 W时，异嗪皮啶产量达到最大，为0.272 mg/g。超声功率过低时，空化效应较弱，不利于提取的进行；超声功率过高时，气泡形成数量较多，并合成更大的气泡，而大气泡内爆强度弱导致削弱超声效果影响提取效率[24]。因此，最佳超声功率500 W。
2.5.3 液固比的影响
图7c 为液固比对异嗪皮啶产量的影响。
从图7c 可以看出，随着液固比的增加，异嗪皮啶产量呈先增加后降低的趋势，当液固比为20∶1 时，异嗪皮啶产量达到最大，为0.287 mg/g。随着液固比的增加，提取效率显著提高，但液固比进一步增加，异嗪皮啶的产量略有下降。当液固比增大时，超声空化的作用导致空化阈值降低，影响了溶剂系统中的声波传播[25-26]，从而导致异嗪皮啶提取效果下降。因此，最佳液固比为20∶1。
2.5.4 超声时间的影响
图7d 为超声时间对异嗪皮啶产量的影响。
从图7d 可以看出，随着超声时间的增加，异嗪皮啶产量呈先增加后降低的趋势，在提取时间20～40 min 时间梯度内，异嗪皮啶产量增至0.298 mg/g，但在50～60 min 的时间梯度下，产量趋于稳定并略有下降，这可能由于到达一定时期后，异嗪皮啶在溶液中达到平衡[27]，导致产量不再提高。因此，最佳超声时间40 min。
2.6 异嗪皮啶提取响应面实验
2.6.1 响应面实验结果
采用Design Expert 13.0 软件对表4 中的数据进行二项式拟合，并对模型进行方差分析，得到二项式拟合方程为Y=0.3122-0.0023A-0.0034B-0.0016C+0.0003AB+0.0008AC+0.0005BC-0.0071A2-0.0129B2-0.0089C2（P＜0.01，R2=0.9941）。
表4 响应面实验编码值与实际值对照
Table 4 Response surface experiment coded values vs.actual values
编码值 实际值序号A B C超声功率/W液固比/(mL/g)超声时间/min Y/(mg/g)1 -1 1 0 400 25∶1 40 0.290 2 -1 -1 0 400 15∶1 40 0.299 3 -1 0 -1 400 20∶1 30 0.301 4 -1 0 1 400 20∶1 50 0.296 5 0 0 0 500 20∶1 40 0.313 6 0 1 1 500 25∶1 50 0.287 7 0 1 -1 500 25∶1 30 0.289 8 0 0 0 500 20∶1 40 0.312 9 0 0 0 500 20∶1 40 0.311 100 -1 -1 500 15∶1 30 0.295 110 -1 1 500 15∶1 50 0.291 121 1 0 600 25∶1 40 0.286 131 0 -1 600 20∶1 30 0.295 141 0 1 600 20∶1 50 0.293 151 -1 0 600 15∶1 40 0.294 160 0 0 500 20∶1 40 0.313 170 0 0 500 20∶1 40 0.312
2.6.2 模型拟合与方差分析
方差分析结果如表5 所示。从二次多项式拟合结果来看，模型P＜0.01，表明该拟合模型具有极显著性，失拟项P＞0.05，模型相关系数R2=0.9941，说明二次多项式方程模型对数据拟合度较高，误差小，模型可靠，可作为异嗪皮啶超声提取工艺的分析测试模型。一次项A（超声功率）、B（液固比）、C（超声时间）影响极显著，二次项A2、B2、C2 影响极显著，由此可知，各影响因素与异嗪皮啶产量之间并不是简单的线性关系。
表5 方差分析结果
Table 5 Results of variance analysis
变异来源 平方和 自由度 均方值 F 值 P 值 显著性模型 0.0015 9 0.0002 131.22 ＜ 0.0001**A 超声功率 0 1 0 31.33 0.0008**B 液固比 0.0001 1 0.0001 70.48 ＜ 0.0001＊＊C 超声时间 0 1 0 16.34 0.0049＊＊AB 0 1 0 0.19 0.6734○AC 0 1 0 1.74 0.2286○BC 0 1 0 0.77 0.4083＊＊A2 0.0002 1 0.0002 164.17 ＜ 0.0001**B2 0.0007 1 0.0007 537.76 ＜ 0.0001**C2 0.0003 1 0.0003 255.08 ＜ 0.0001**残差 0 7 0 —失拟项 0 3 0 2.98 0.1597○纯误差 0 4 0 —总和 0.0015 16 —
2.6.3 响应面分析
采用Design Expert 13.0 软件绘制异嗪皮啶产量、超声功率、液固比、超声时间之间的三维曲面图，结果如图8～10 所示。
图8 超声功率、液固比对异嗪皮啶产量的响应曲面及等高线图
Fig. 8 Response surface and contour plot of ultrasonic power and liquid-solid ratio on yield of isofraxidin
图9 超声功率、超声时间对异嗪皮啶产量的响应曲面及等高线图
Fig. 9 Response surface and contour plot of ultrasonic power and ultrasonic time on yield of isofraxidin
图10 液固比、超声时间对异嗪皮啶产量的响应曲面及等高线图
Fig. 10 Response surface and contour plot of liquid-solid ratio and ultrasonic time on yield of isofraxidin
由响应面图可得到优化条件为：超声功率480 W、液固比19∶1、超声时间39 min。
2.6.4 工艺验证结果
根据Design Expert 13.0 软件分析得到的优化条件超声功率480 W、液固比19∶1、超声时间39 min 进行3 次验证实验，结果如表6 所示。
表6 验证结果
Table 6 Verification test results
实验次数1 2 3 平均值 预测值Y/(mg/g) 0.314 0.309 0.313 0.312 0.316偏差/% -0.10 -0.35 -0.15
从表6 可以看出，异嗪皮啶产量为0.312 mg/g，与预测值之间的偏差为-0.20%，实验结果与预测值接近，说明该模型可靠，该优化条件是可行的。
3 结论
通过离子液体辅助发酵菌生物转化刺五加苷B1，并通过超声提取制备异嗪皮啶，通过单因素实验和响应面实验优化制备工艺。
（1）经筛选，最佳的发酵菌种为植物乳杆菌；最佳的离子液体为[C4MIM]Br。
（2）异嗪皮啶生物转化制备单因素实验和响应面实验确定，最优反应条件为pH=6.0、液固比为25∶1、发酵温度36.5 ℃、发酵时间36 h、[C4MIM]Br浓度 0.57 mol/L。在此条件下，异嗪皮啶产量为0.257 mg/g。
（3）异嗪皮啶超声提取单因素实验和响应面实验确定，最优反应条件为甲醇体积分数100%、超声功率480 W、液固比19∶1、超声时间39 min。在此条件下，异嗪皮啶产量为0.312 mg/g。
采用离子液体辅助植物乳杆菌发酵中药刺五加，并通过超声提取，可以显著提高异嗪皮啶的产量。本文对异嗪皮啶的制备方法可以为食品工业和规模化生产提供参考。
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金 爽（1984—），女，副教授，E-mail：jinshuangzy@163.com。
联系人：赵华勇（2004—），男，E-mail：zzhao9886@gmail.com。
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