青海湖位于青藏高原东北部，是中国最大的内陆湖，湖泊面积约为4625.6 km2。青海湖生态环境脆弱，受气候变化、人类活动等因素影响较大。刚毛藻(Cladophora）属于绿藻门、绿藻纲、刚毛藻目，是一种淡水藻类植物，也是一类独特的生物，在中国生态环境中占据重要的地位[1]。青海湖刚毛藻的发现为中国藻类植物的生物多样性增添了新的色彩。而近年来，青海湖面临的一大生态环境问题便是刚毛藻的过度繁殖。

刚毛藻可以栖息于盐度和温度范围较宽的水域，其耐受力远高于陆生植物，在高盐度的水域中可产生大量生物质，具有很高的生产潜力[2]。近年来，人们对动物源性食物需求量增加，各种替代饲料被广泛关注。微藻作为替代饲料蛋白具有极高的研究价值[3-6]，而刚毛藻生物质丰富多样的生化含量使其在农业、水产养殖中具有广泛的应用潜力，但国内外对于刚毛藻蛋白的开发利用不足。因此，对刚毛藻蛋白的开发利用可以缓解目前中国蛋白质资源紧张的现状、提高刚毛藻的经济附加值，并能解决环境污染问题。泡沫分离是一种操作简单、能耗低、效率高、易工业放大的环保分离技术，近年来在中国得到了广泛关注与应用。泡沫分离利用泡沫的表面活性剂性质，通过泡沫层对混合物中的目标物质进行选择性吸附，从而实现有效分离。泡沫分离应用背景广泛，涵盖了石油、化工、食品、环保等多个领域[7-8]。

本文拟以泡沫分离技术对青海湖刚毛藻蛋白进行提取，并对该蛋白的结构与性质进行表征和测试，在单因素实验的基础上，将回收率和富集比作为指标采用响应面法探究其提取工艺的最佳条件。以期为青海湖刚毛藻蛋白的开发与利用提供理论支撑。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

青海湖刚毛藻(Cladophora qinghaiensis）、牛血清白蛋白标准品，上海源叶生物科技技术有限公司；考马斯亮蓝G250、氢氧化钠、浓盐酸(质量分数37%）、磷酸、石油醚、无水乙醇，分析纯，利安隆博华(天津）医药化学有限公司；十二烷基硫酸钠(SDS，质量分数>95%）、大豆油，武汉皓晟商贸有限公司；蒸馏水，自制。

UH-24 型高压细胞破碎机，永联生物科技(上海）有限公司；PB-10 型酸度计，赛多利斯科学仪器(北京）有限公司；TU-1901 型双光束紫外-可见分光光度计(UV-Vis），北京普析通用仪器有限责任公司；VFD-2000 型冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司；H1850 型高速离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；IRSpirit-X 型傅里叶变换红外光谱仪(FTIR），日本Shimadzu 公司；Biochrom 30+型氨基酸分析仪，英国Biochrom 公司；泡沫分离装置(图1），自制。

1.2 方法

青海湖刚毛藻经清洗、分离、冷冻干燥(–75 ℃，24 h）、索氏提取(采用索氏提取器，用石油醚对青海湖刚毛藻粉进行脱脂处理，65 ℃，8 h）等方法处理后，得到青海湖刚毛藻粉。以蒸馏水为提取剂，配制不同料液比(g∶L，下同）的藻液，利用高压细胞破碎机(50 MPa、2 min）进行破壁处理，然后碱溶(pH=10.0、温度 50 ℃、时间 2 h）、离心(8000 r/min、10 min），调节pH 后得到蛋白液；将蛋白液添加至泡沫分离装置(图1）的泡沫分离柱中，以转子流量计控制固定气体流速(500 mL/min），由泡沫接收器收集分离后蛋白液，进一步冷冻干燥(–75 ℃，24 h）得蛋白粉。

根据式(1）和(2）计算青海湖刚毛藻蛋白的回收率(R，%）和富集比(E）[9]：

式中：V0、Vf 和Vs 分别为初始蛋白液、泡沫层蛋白液和残留蛋白液体积，mL；ρ0、ρf、ρs 分别为初始蛋白液、泡沫层蛋白液和残留蛋白液中蛋白质量浓度，μg/mL。

1.3 表征方法与性能测试

1.3.1 FTIR 测试

KBr 压片法，波数范围4000 ～400 cm–1，分辨率4 cm–1，扫描次数32 次。

1.3.2 UV-Vis 吸收光谱测定

用浓度 0.5 mol/L 的醋酸溶液配制质量浓度2 g/L 的青海湖刚毛藻蛋白溶液，以浓度0.5 mol/L的醋酸溶液为空白，通过UV-Vis 在波长200 ～400 nm进行扫描。

1.3.3 蛋白持水量测定

蛋白持水量(也称蛋白质的水结合能力）是指蛋白质分子能够结合水的量。将0.05 g 蛋白粉和5 mL 蒸馏水混合，考察不同温度(20、30、40、50、60、70 ℃）对持水量的影响。水浴加热1 h 后，3000 r/min 离心15 min 并除去上清液，根据式(3）测定持水量(w，g/g）：

式中：m 为样品质量，g；m1 为样品和离心管的总质量，g；m2 为沉淀和离心管的总质量，g。

1.3.4 蛋白持油量测定

将0.05 g 蛋白粉和5 mL 大豆油混合，考察不同温度(20、30、40、50、60、70 ℃）对持油量的影响。水浴加热1 h 后，3000 r/min 离心15 min 并除去上清液，根据式(4）测定持油量(o，g/g）：

式中：m 为样品质量，g；为样品和离心管的总质量，g；为沉淀和离心管的总质量，g。

1.3.5 蛋白起泡性和泡沫稳定性测定

将蛋白粉(0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 g）分别加入到20 mL 蒸馏水溶解，均质机10000 r/min搅拌2 min，测其泡沫体积，30 min 后再测泡沫体积，根据式(5）计算起泡性(t，%），根据式(6）计算泡沫稳定性(ts，%）：

式中：V 为溶液体积，mL；V1 为均质结束后泡沫体积，mL；V2为均质结束后30 min 时泡沫体积，mL。

1.3.6 蛋白乳化能力和乳化稳定性测定

将蛋白粉(0.08、0.12、0.16、0.20、0.24 g）分别加入到20 mL 蒸馏水溶解，分别得到含量(以蒸馏水质量计，下同）为0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%的溶液，再加入 10 mL 大豆油，均质机10000 r/min 搅拌2 min。吸取20 μL 底部乳液与5 mL质量分数0.1%的SDS 溶液混合。以质量分数0.1%的SDS 溶液作空白对照，测定其在500 nm 处的吸光度(A500）。30 min 后再次测定吸光度(A500/30），根据式(7）计算乳化能力(e，%），根据式(8）计算乳化稳定性(e s，%）：

1.3.7 氨基酸含量测定

采用氨基酸分析仪对蛋白进行测定[9]。缓冲液流速20 mL/h，反应流速10 mL/h。采用Na 型阳离子树脂层析柱作为分离柱，其长度和直径分别为200和4.6 mm。紫外检测波长570、440 nm。柱温采用55 ℃→65 ℃→77 ℃(升温速率3 ℃/min，分别保持10.25、13.50、24.30 min）程序升温的方式，反应槽温度138 ℃。进样量50 μL，以柠檬酸钠缓冲液作缓冲体系(pH=3.20、4.25、6.45）。0.04 mol/L氢氧化钠溶液作再生溶液。氨基酸经分离柱分离后与茚三酮反应，其反应生成的物质由紫外-可见分光光度计检测，根据测定的氨基酸含量(x，mg/g）-吸光度(y）标准曲线拟合方程y=5.5728x–0.0186(R2=0.99834），计算测定溶液吸光度对应的氨基酸含量。

1.4 单因素实验

按1.2 节青海湖刚毛藻蛋白的提取方法，在料液比7.5∶1.0、温度30 ℃、载液量225 mL 的条件下，考察pH(4.5、5.0、5.5、6.0、6.5）对青海湖刚毛藻蛋白提取效果的影响；在pH 5.0、温度30 ℃、载液量225 mL 的条件下，考察料液比(5.0∶1.0、7.5∶1.0、10.0∶1.0、12.5∶1.0、15.0∶1.0）对青海湖刚毛藻蛋白提取效果的影响；在pH 5.0、料液比7.5∶1.0、载液量225 mL 的条件下，考察温度(25、30、35、40、45 ℃）对青海湖刚毛藻蛋白提取效果的影响；在pH 5.0、温度30 ℃、料液比7.5∶1.0 的条件下，考察载液量(200、225、250、275、300 mL）对青海湖刚毛藻蛋白提取效果的影响，以回收率和富集比为评价指标。

1.5 响应面实验设计

根据单因素实验结果，以pH(A）、温度(B）、载液量(C）和料液比(D）为自变量，回收率和富集比为评价指标，设计响应面实验如表1 所示，对4 个因素分别设置3 个水平，用“–1、0、1”表示，pH、温度、载液量和料液比根据单因素研究结果中心点取值。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验分析

2.1.1 pH 的影响

图2 为pH 对青海湖刚毛藻蛋白回收率和富集比的影响。

从图2 可以看出，随着pH 的升高，青海湖刚毛藻蛋白回收率先升高后降低，而富集比一直呈下降趋势。这是因为，pH 在等电点(5.5）附近时，蛋白有疏水性，易吸附在泡沫表面，提升泡沫的黏度和稳定性，降低其表面张力；当pH 偏离等电点时，泡沫变大且易碎，易聚合，泡沫层排液量加大，液体持流量减小，导致回收率降低。而富集比的持续下降是因为随着pH 的增加，起泡性增强，泡沫液膜变厚，持液量增加。因此，综合考虑回收率和富集比，选择pH=5.0 进行后续考察[10]。

2.1.2 料液比的影响

图3 为料液比对青海湖刚毛藻蛋白回收率和富集比的影响。

从图3 可以看出，随着料液比的增加，青海湖刚毛藻蛋白回收率先升高后下降，富集比呈先下降后上升趋势。这是因为，料液比的增加会提高蛋白溶液质量浓度，容易产生大量稳定泡沫，泡沫聚并现象弱，由于泡沫附带了较多的蛋白溶液，且泡沫上升过程变快，导致蛋白液不易回流，继续增加料液比，易形成胶束，导致泡沫分离效果不明显。因此，综合考虑回收率和富集比，选择料液比7.5∶1.0进行后续考察[11]。

2.1.3 温度的影响

图4为温度对青海湖刚毛藻蛋白回收率和富集比的影响。

从图4 可以看出，随着温度的升高，青海湖刚毛藻蛋白回收率呈先升高后降低的趋势，富集比现先降低后升高的趋势。这是因为，当温度＜30 ℃时，溶液的黏度和表面张力极强，回流速率小，泡沫稳定性低；当温度>30 ℃后，泡沫回流加快，泡沫强度降低，导致泡沫稳定性变差。因此，综合考虑回收率和富集比，选择温度30 ℃进行后续考察[12]。

2.1.4 载液量的影响

图5为载液量对青海湖刚毛藻蛋白回收率和富集比的影响。

从图5 可以看出，随着载液量的增加，青海湖刚毛藻蛋白回收率呈先升高后降低的趋势，富集比呈先降低后升高的趋势。这是因为，载液量的增加，泡沫在液体层停留时间变长，泡沫体积增大会附着更多蛋白，泡沫层停留时间变短，影响排液，导致回收率升高、富集比下降；当蛋白吸附接近饱和后，再增加载液量，则会降低回收率、提高富集比。因此，综合考虑回收率和富集比，选择载液量225 mL进行后续考察[13]。

2.2 响应面实验分析

2.2.1 响应面实验结果

表2为响应面实验结果。

利用Design-Expert 13 软件对表2 数据进行二项式拟合，并对模型进行方差分析，得到二项式拟合方程为R=97.33+5.0200A+0.3825B–0.1417C+4.7800D–0.3375AB–0.3150AC–3.6700AD–0.5050BC–0.4850BD–1.9500CD–6.1800A2–3.3300B2–2.7700C2–5.5200D2(P＜0.0001，R2=0.9775）；E=2.2600–0.2192A– 0.0108B–0.0567C–0.1683D+0.0875AB–0.0250AC–0.0825A D+0.0300BC–0.0300BD–0.0325CD–0.2024A2–0.2199 B2–0.2337C2+0.1737D2(P＜0.0001，R2=0.9770）。

2.2.2 模型拟合与方差分析

表3、4 分别为回收率和富集比的方差分析结果。

从表3、4 可以看出，两个模型P 值均＜0.0001，F 值(43.35 和42.4200）均>0.05，代表两回归模型可行性强，可用于设计内预测。

从表3 还可以看出，回收率模型的相关系数(R2）为0.9775，意味着响应值有97.75%的变化，调整后相关系数R2Adj 为0.9549，表明该模型拟合程度良好，且误差较小；影响因素从大到小依次为A>D>B>C。

从表4 还可以看出，富集比模型的R2=0.9770，意味着响应值有97.70%的变化，调整后的相关系数R2Adj 为0.9539，这表明该模型拟合程度良好，且误差较小；影响因素大小顺序为A>D>C>B[14-15]。

2.2.3 响应面分析

采用Design-Expert 13 软件绘制青海湖刚毛藻蛋白回收率和pH、温度、载液量、料液比之间的三维曲面图，结果如图6 所示；青海湖刚毛藻蛋白富集比和pH、温度、载液量、料液比之间的三维曲面图，结果如图7 所示。

综合分析以上结果并结合回归模型，最佳优化条件为：pH=4.974、温度为30.016 ℃、载液量为222.670 mL、料液比为7.553∶1.0。在上述条件下，青海湖刚毛藻蛋白回收率为 97.144%，富集比为2.275。

2.2.4 工艺验证结果

为验证此最佳优化工艺和条件，并结合实际情况，选用 pH=5.0、温度为 30.0 ℃、载液量为225 mL、料液比 7.5∶1.0，在此条件下蛋白回收率为96.98%，富集比为2.26。接近预测值，证明此工艺可行，该模型可用于泡沫分离青海湖刚毛藻蛋白。

2.3 青海湖刚毛藻蛋白的功能分析

2.3.1 持水性分析

图8 为温度对青海湖刚毛藻蛋白持水量的影响。

从图8 可以看出，随着温度的升高，青海湖刚毛藻蛋白持水量大体上呈先降低后升高的趋势，20 ℃时其持水性最强，为5.32 g/g。这是因为，适宜的温度会引起蛋白质一定的热变性，更有利于蛋白质分子的伸展，增强蛋白质分子与水的作用力；温度升高则会增加蛋白质分子间的作用力，附着水的能力下降，导致持水性下降[16]。当温度>60 ℃后，持水量上升，这是因为，形成的一种新的水-蛋白质相互作用平衡状态使水分子在蛋白质表面稳定结合。

2.3.2 持油性分析

图9 为温度对青海湖刚毛藻蛋白持油量的影响。

从图9 可以看出，随着温度的升高，青海湖刚毛藻蛋白持油量呈先升高后降低的趋势，50 ℃时其持油量最高，为10.26 g/g。这是因为，随着温度的升高，蛋白质分子空间结构不断伸展，疏水基团部分暴露，使其持油性增强；当温度>50 ℃后，油的流动性不断增加，持油性降低[17]。

2.3.3 起泡性和起泡稳定性分析

图10 为青海湖刚毛藻蛋白含量对其起泡性和起泡稳定性的影响。

从图10 可以看出，随着青海湖刚毛藻蛋白含量的增加，其起泡性和起泡稳定性均呈先升高后降低的趋势。青海湖刚毛藻蛋白含量为1.0%时，其起泡性和起泡稳定性达到最高，为90.0%和72.2%。这是因为，蛋白质在一定的含量范围时，随蛋白含量的增加，蛋白溶液黏性增加，泡沫容易形成且稳定；而超过此范围后，黏度过大破坏了平衡，导致泡沫不易形成且不稳定[18]。

2.3.4 乳化性和乳化稳定性分析

图11 为青海湖刚毛藻蛋白含量对其乳化能力和乳化稳定性的影响。

从图11 可以看出，随着青海湖刚毛藻蛋白含量的增加，其乳化能力和乳化稳定性均呈先升高后降低的趋势。青海湖刚毛藻蛋白含量为1.0%时，其乳化能力和乳化稳定性达到最高，分别为70.8%和76.7%。这是因为，当蛋白质含量在一定范围内时，含量越高，大豆油分布越广泛，并且在一定程度上黏性增强，而超过这个范围后，黏性的增强破坏了乳化能力和乳化稳定性的平衡，导致其开始降低[19]。

2.4 表征分析

2.4.1 FTIR 分析

图12 为青海湖刚毛藻蛋白的FTIR 谱图，图13为FTIR 谱图中1700 ～1600 cm–1 酰胺Ⅰ带的二阶导数拟合谱图。

从图12 可以看出，青海湖刚毛藻蛋白有许多特征峰，2980 ～2850 cm–1 为饱和碳C—H 伸缩振动；1700 ～1600 cm–1 为酰胺Ⅰ带(C==O 伸缩振动）；1600 ～1500 cm–1 为酰胺Ⅱ带(C—N 伸缩振动和N—H变形振动)；1420 ～1350 cm–1 为 C—OH 振动；1350 ～1200 cm–1 为酰胺Ⅲ带(C—O 和C—O—C 振动）；1100 ～1060 cm–1 为P==O 或P—O—C 对称伸缩振动[20-21]。

经计算，青海湖刚毛藻蛋白二级结构以β-转角为主，相对含量为 33.48%，β-折叠相对含量为28.92%，无规则卷曲相对含量为20.30%，α-螺旋相对含量为17.30%。

2.4.2 UV-Vis 吸收光谱分析

图14 为青海湖刚毛藻蛋白的UV-Vis 吸收光谱。

从图14 可以看出，青海湖刚毛藻蛋白在280 nm左右具有最大吸收。这是因为，蛋白中含有具有共轭双键的芳香族氨基酸，如色氨酸、酪氨酸等。

由于肽键中的羰基电子跃迁，在230 nm 处有吸收峰，符合Ⅰ型胶原蛋白三股螺旋结构的紫外吸收特征[22]。

2.5 氨基酸组成分析

表5 为青海湖刚毛藻蛋白氨基酸组成的测定结果。

从表5 可以看出，青海湖刚毛藻蛋白中总氨基酸含量可达422.453 mg/g，其中谷氨酸含量最高，为63.479 mg/g，占总氨基酸的质量分数15.03%；必需氨基酸(苏氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、组氨酸）总含量为132.419 mg/g，占总氨基酸的质量分数31.35%；疏水氨基酸(丙氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸）总含量为164.676 mg/g，占总氨基酸的质量分数38.98%[23]。

3 结论

以泡沫分离法对青海湖刚毛藻蛋白进行提取，通过单因素实验和响应面实验对提取工艺进行优化，同时对青海湖刚毛藻蛋白的理化性质进行了分析，确定了其氨基酸组成。

(1）青海湖刚毛藻蛋白泡沫分离法提取最佳条件为pH=5.0、温度为30.0 ℃、载液量为225 mL、料液比(g∶L）7.5∶1.0。在此条件下，蛋白回收率为96.98%，富集比为2.26。

(2）青海湖刚毛藻蛋白持水量和持油量在20和50 ℃时最大，分别为5.32 和10.26 g/g。在含量0.4% ～1.2%内，青海湖刚毛藻蛋白乳化能力和乳化稳定性、起泡性和泡沫稳定性均呈先上升后下降的趋势，并都在含量为1.0%时达到最佳。

(3）青海湖刚毛藻蛋白在230 和280 nm 处有蛋白特征峰；蛋白二级结构中β-转角相对含量最大，为33.48%。

(4）青海湖刚毛藻蛋白中总氨基酸含量可达422.453 mg/g，谷氨酸含量最高为63.479 mg/g，占总氨基酸质量分数15.03%；必需氨基酸总含量为132.419 mg/g，占总氨基酸的质量分数31.35%；疏水氨基酸总含量为164.676 mg/g，占总氨基酸的质量分数38.98%。

本文可以为青海湖刚毛藻蛋白研究开发提供必要的实验依据。

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Optimization of protein foam separation process and physicochemical properties of Cladophora qinghaiensis

MA Yanbin, ZHANG Wei*, ZHAO Heran
(School of Chemistry and Chemical Engineering, Qinghai Normal University, Xining 810008, Qinghai, China）

Abstract: The foam separation method was used to extract the protein from Cladophora qinghaiensis(protein for short), and the extraction process was optimized by single factor experiments and response surface methodology with recovery rate and enrichment ratio as indexes. The protein obtained was characterized by FTIR, UV-Vis absorption spectrum and amino acid analyzer to determine its amino acid composition. The results showed that under the optimum conditions of sodium dodecyl sulfate as surfactant,pH=5.0, temperature 30.0 ℃, liquid load 225 mL and solid to liquid ratio (g∶L) 7.5∶1.0, the recovery rate and enrichment ratio of the protein were 96.98% and 2.26. In the range of 20 ～70 ℃, the maximum water and oil holding capacity of the protein was 5.32 and 10.26 g/g at 20 and 50 ℃, respectively. The emulsifying ability, emulsifying stability, foamability and foam stability of the protein increased first and then decreased along with the content (based on the mass of distilled water, the same below) changing from 0.4% to 1.2%, while all reached the optimum when the content was 1.0%. The protein showed characteristic peaks at 230 and 280 nm, and the relative content of β-turn in the protein secondary structure was the highest of 33.48%. The total amino acid content of the protein reached 422.453 mg/g, wth the glutamic acid content the highest (63.479 mg/g), accounting for 15.03% of the mass of total amino acid, while that of essential amino acids (threonine, valine, methionine, etc.) was 132.419 mg/g, accounting for 31.35% of the mass of the total amino acid. The total content of hydrophobic amino acids (alanine, valine, methionine, etc.)was 164.676 mg/g, accounting for 38.98% of the mass of total amino acid.

Key words: response surface methodology; foam separation process; protein from Cladophora in Qinghai Lake; functional properties; structural analysis; separation and purification

中图分类号: TQ936

文献标识码: A

文章编号: 1003-5214 (2025) 12-2717-10

收稿日期: 2024-10-29; 定用日期:2024-11-27;

DOI: 10.13550/j.jxhg.20240816

基金项目: 国家自然科学基金项目(22268035）

作者简介: 马琰彬(1999—），男，硕士生，E-mail：643500183@qq.com。联系人:张 炜 (1972—），女，教授，E-mail：zhangwei@qhnu.edu.cn。