DOI:10.13550/j.jxhg.20240896
中图分类号:O643.36
多因素响应蛋白纳米笼封装Pt纳米催化剂的制备及催化4-硝基苯酚加氢性能
张盟1， 王一龙2， 刘志丹1， 时晓晖1， 刘爱洁3， 易霞4， 朱劼1,2,4
| 【作者机构】 | 1常州大学石油化工学院； 2常州大学药学院生物与食品工程学院； 3厦门大学药学院； 4生物质高效炼制及高质化利用国家地方联合工程研究中心 |
| 【分 类 号】 | O643.36 |
| 【基 金】 | 国家自然科学基金项目（22278040） |
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多因素响应蛋白纳米笼封装Pt纳米催化剂的制备及催化4-硝基苯酚加氢性能
随着纳米科学与材料化学的快速发展，超分子纳米笼凭借其独特的限域效应、出色的分子识别能力和高选择催化活性，在催化领域的应用研究中受到了广泛关注[1-2]。超分子纳米笼的纳米结构为催化反应提供了一个理想的微环境，在提升反应效率、产物选择性和催化剂稳定性方面表现出显著的优势[3-5]。
蛋白纳米笼，特别是病毒样颗粒（VLPs）是一种天然存在的限域结构，相较于一些化学合成的限域体系，如沸石分子筛[6-8]、碳纳米材料[9-12]、金属有机框架材料[13-15]等，具有单分散和高度有序的结构特征及分布广泛、种类丰富、可再生的优势。以豇豆褪绿斑驳病毒（CCMV）衣壳蛋白（CP）自主装配形成的蛋白纳米笼呈现出二十面体对称结构〔三角形剖分数（T）=3〕，外径约28 nm，内部空腔直径约18 nm，由180个相同的CP亚单位组装而成（图1）[16-17]。此类VLPs在生物催化及药物传输等领域展现出重要的应用前景。近年来，研究人员利用VLPs封装不同种类催化剂，包括金属颗粒、酶类及有机金属小分子等，构建限域催化体系，并开展了多项催化反应研究[18-24]。朱劼等[23]制备了天然CCMV蛋白纳米笼封装Ru纳米催化剂（Ru@CCMV），并将其应用于肉桂醛加氢模型反应，其表现出较高的催化活性。天然蛋白纳米笼的自组装过程尽管具备诸多独特优势，然而，环境因素（pH、离子强度和静电作用等）往往会显著影响其自组装过程中蛋白的稳定性和自组装行为，进而影响蛋白纳米笼的形成和催化性能。具体而言，CCMV衣壳在pH=3～6，且离子强度约为0.1 mol/L的条件下，能够保持稳定存在；然而，pH上升至7.5，同时离子强度增至1.0 mol/L时，衣壳将解离为蛋白二聚体[25-26]，即其笼形结构遭到破坏。因此，如何开发一种能在不同环境条件下保持相对稳定的自组装蛋白纳米笼体系，对于提升其在催化领域的应用价值具有重要意义。
图1 CCMV衣壳形貌[16-17]
Fig. 1 CCMV capsid morphology[16-17]
弹性蛋白样多肽（ELP）是一种对温度敏感的多肽，其结构是由9个重复的缬氨酸-脯氨酸-甘氨酸-X-甘氨酸（Val-Pro-Gly-X-Gly）（VPGXP）五肽单元构成，其中，X代表除脯氨酸外的任意一种天然氨基酸[27-28]。天然ELP序列为：VPGVG-VPGLGVPGVG-VPGLG-VPGVG-VPGLG-VPGGG-VPGVGVPGLG，以通用符号ELP[V4L4G1-9]来描述，下标数字（4、4、1）为客体残基的比例，9为五肽重复序列的数量[29-31]。ELP分子结构富含疏水基团及弹性结构域，能够根据温度或盐含量的变化，在亲水性与疏水性之间实现可逆转换[27]。通过将ELP与病毒CP共表达，可实现热响应自组装。这一方法有效解决了天然蛋白纳米笼稳定性不足的问题。通过调控温度，可以实现对蛋白纳米笼自组装过程的精细控制，避免了传统自组装方法中对于pH、离子强度等多种环境因素的严格依赖。在特定温度范围内，仅需简单调整温度，即可实现蛋白纳米笼的自组装与解组装，操作简便快捷，有利于实现大规模制备与应用；此外，热响应自组装所形成的蛋白纳米笼结构展现出高度的稳定性和良好的重复性，为后续催化剂的封装及催化性能研究奠定了坚实的基础。
本文拟采用大肠杆菌（E. coli）BL21共表达一种对多重环境因素具有响应性的ELP-CCMV CP融合蛋白，并对天然ELP进行改造，将其结构域第1和第8两个五肽中的客体缬氨酸（V）突变为色氨酸（W），获得一种更具疏水性的ELP，以进一步提升蛋白笼的稳定性，将其封装Pt纳米颗粒，制备一种蛋白笼结构限域的Pt纳米催化剂。然后，以4-硝基苯酚（4-NP）的催化还原反应为模型，对蛋白笼结构限域的Pt纳米催化剂的催化活性进行评价。以期为生物纳米材料和仿生催化等前沿领域中VLPs的规模化生产提供一种简便且环境友好的技术方案，并为此领域的技术创新和应用开辟新的潜力。
1 实验部分
1.1 材料、试剂与仪器
原核表达载体pET28(+)、大肠杆菌BL21(DE3)，上海天霖生物科技有限公司；蛋白Marker、PCR扩增试剂盒，上海捷瑞生物工程有限公司。
卡那霉素、三羟甲基氨基甲烷（Tris），青岛生工生物科技有限公司；Future PAGE蛋白预制胶、Running Buffer，常州伯仪生物科技有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物，英国OXOID公司；T4 DNA连接酶、限制性内切酶（NcoI、BamHI）、Tango Buffer（10X），美国Thermo Fisher Scientific公司；NaCl、MgCl2、咪唑、NaBH4、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），AR，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；4-NP、柠檬酸钠、冰醋酸、无水乙醇、二硫苏糖醇（DTT）、乙酸钠（NaAc），AR，上海麦克林生化科技有限公司；氯铂酸水合物，AR，天津希恩思生化科技有限公司；Ni-NTA Beads 6FF，常州天地人和生物科技有限公司。
JEM-2010型透射电子显微镜（TEM），日本电子株式会社；NANO-ZS-ZEN 3600型纳米粒度分析仪，英国马尔文仪器有限公司；Avio 550 MAX型电感耦合等离子体发射光谱仪（ICP-OES）、DSC 8500型差示扫描量热仪（DSC），美国Perkin Elmer仪器有限公司；BMG POLARstar Omega全波长多功能酶标仪，德国BMG Labtech公司；Tanon 1600型凝胶成像系统，上海天能科技有限公司；PHI 5000 VersaProbeⅢ型X射线光电子能谱仪（XPS），日本ULVAC-PHI公司。
1.2 方法
1.2.1 菌株及其培养
LB培养基配制：LB液体培养基（均为质量浓度，g/L）：蛋白胨10、酵母浸粉5.0、NaCl 10，pH=7.0，121 ℃灭菌20 min。LB固体培养基灭菌前添加质量浓度为15 g/L的琼脂。灭菌后，培养基冷却至50 ℃再添加终浓度为50 mg/L的硫酸卡那霉素。培养温度37 ℃，摇床转速200 r/min。
重组菌株在LB培养基中培养，卡那霉素使用时终质量浓度为25 mg/L。
1.2.2 重组质粒的制备
以实验室保存的天然CCMV序列为原始模板，利用ELP序列替代CCMV的N末端阳离子核酸结合结构域（ARD），并在ELP序列前端添加His标签，构建Native ELP-(Δ26)CCMV CP（NCP）。之后，将ELP的第1个和第8个客体残基处的缬氨酸突变为色氨酸，构建VW1-VW8 ELP-(Δ26)CCMV CP（VCP）（上海天霖生物科技有限公司），如图2所示。PCR扩增体系为DNA模板1.0 μL、引物混合物2.0 μL、超纯水7.0 μL、RT-qPCR酶为10.0 μL。PCR扩增条件为96 ℃预变性5 min，96 ℃变性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，24个循环，最后72 ℃延伸10 min。
图2 CCMV和ELP-CCMV蛋白结构图
Fig. 2 Protein structures of CCMV and ELP-CCMV
Native ELP-CP的正向引物是5-CATGCCATG GGACATCACCATCATCATC-3（CCATGG），反向引物是5-CGCGGATCCTTAATACACCGGAGTG AAAGAG-3（GGATCC）。VW1-VW8 ELP-CCP的正向引物是5-CATGCCATGGGTCACCATCACCA TCAC-3（CCATGG），反向引物是5-CGCGG ATCCT TAA TACACCGGAGTGAAAAGAG-3（GGATCC）。
T4 DNA连接酶连接CCMV CP目的基因片段和载体pET28a(+)，得到重组质粒pET28a(+)- NCP和pET28a(+)-VCP。用NcoI和BamHI内切酶进行双酶切回收CCMV CP目的片段及载体pET28a(+)。通过质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳对重组质粒进行双酶切验证。双酶切体系为NcoI（1 µL）、BamHI（1 µL）、Plasmid（5 µL）、10×Buffer Tango（8 µL）、超纯水（5 µL）。
1.2.3 基因工程菌的制备
将10 μL重组质粒加入到100 μL大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，冰上静置30 min，在42 ℃下热激90 s后，立即置于冰上静置1 min，LB液体培养基补足至1 mL，混匀后在37 ℃、150 r/min振荡条件下培养复苏1 h，低速离心后将剩余培养基涂布于含卡那霉素的LB培养基平板上，在37 ℃下培养过夜。构建的菌株分别记为重组菌株NCP和重组菌株VCP。
1.2.4 目标蛋白的纯化
复苏菌种，在37 ℃下过夜培养活化。接种量为1%（体积分数），接入扩大培养基中，在37 ℃下培养至吸光度0.4时，加入浓度0.1 mol/L的IPTG，24 ℃诱导过夜。结束发酵后，在4 ℃、10000 r/min下离心10 min，收集菌体。加入溶菌酶进行超声破碎（冰浴，功率300 W，运行1 s，间隙2 s，20 min）。裂解后，在4 ℃、12000 r/min下离心20 min，收集上清，使用0.45 μm滤头过滤，得到CCMV CP粗蛋白溶液。
将过滤后的上清与平衡后的Ni-NTA琼脂糖树脂填料充分结合，依次向吸附柱中加入浓度50、500 mmol/L的咪唑缓冲液，收集洗脱液。使用超滤离心管浓缩CCMV CP粗蛋白溶液，收集超滤管中浓缩液体，即为CCMV CP蛋白纯化液，置于4 ℃保存备用。
1.2.5 融合蛋白封装Pt纳米催化剂的制备
采用原位还原法制备NCP和VCP封装Pt纳米催化剂。将1.000 mL浓度0.165 mmol/L组装状态下的NCP和VCP VLPs与0.420 mL浓度6 mmol/L的氯铂酸水溶液充分混匀，室温下搅拌30 min，再向溶液中加入0.126 mL浓度0.1 mol/L的NaBH4溶液，匀速搅拌25 min，搅拌结束后，将反应液置于截留相对分子质量3 kDa的透析袋中，使用组装缓冲液（由浓度0.1 mol/L NaAc、0.3 mol/L NaCl、0.01 mol/L MgCl2组成，pH=4.8）透析过夜。最后，得到NCP和VCP封装Pt纳米催化剂，分别记为Pt@NCP和Pt@VCP。
1.2.6 柠檬酸稳定的Pt纳米催化剂的制备
将1.000 mL质量分数1%的柠檬酸钠和0.420 mL浓度6 mmol/L的氯铂酸水溶液充分混匀，常温下800 r/min匀速搅拌30 min。之后，加入0.126 mL浓度0.1 mol/L的NaBH4水溶液，继续搅拌25 min。最后得到柠檬酸稳定的Pt纳米催化剂胶体溶液，记为Pt-CA。
1.3 表征方法与性能测试
TEM测试：取部分样品分散到无水乙醇中进行超声，取几滴分散好的液体逐滴滴加到铜网上，经过晾干后，加速电压100 kV，选中位置逐级放大拍摄。XPS测试：Al Kα为射线源，并以C 1s（284.8 eV）为基准对数据进行校正。ICP-OES测试：向150 µL Pt催化剂水分散液中加1 mL王水，在90 ℃下加热至蒸干，超纯水定容至10 mL，稀释一定倍数后进行测试。
1.4 融合CP自组装因素实验
1.4.1 pH对融合蛋白体外自组装的影响
将纯化后的蛋白壳装入透析袋中，在分解缓冲液（0.02 mol/L Tris-HCl、0.3 mol/L NaCl、0.001 mol/L DTT、0.01 mol/L MgCl2，pH=7.4）中，在25 ℃下透析24 h。将分解后的蛋白壳在重组缓冲液（浓度0.1 mol/L NaAc、0.3 mol/L NaCl、0.01 mol/L MgCl2，pH=4.8）中透析，在25 ℃下透析24 h。
1.4.2 盐浓度对融合蛋白体外自组装的影响
考察pH=4.8和7.4时，NaCl浓度对VLPs的影响。在两个pH下，使用14 kDa透析袋分别将质量浓度0.5 g/L的NCP和VCP融合蛋白浸入分解缓冲液中，在25 ℃下透析24 h。分解完全后，NCP和VCP溶液分别置于浓度0～0.9和0～2.4 mol/L的NaCl组装缓冲液中透析24 h。
1.4.3 温度对融合蛋白体外自组装的影响
将质量浓度0.5 g/L的CCMV CP装入到14 kDa透析袋中，在分解缓冲液中4 ℃透析24 h。采用DCS测试4～40 ℃的NCP和VCP自组装相变温度。
1.5 蛋白笼封装Pt纳米催化剂性能的测试
以4-NP催化加氢还原生成4-氨基苯酚（4-AP）为模型反应，评价蛋白笼封装Pt纳米催化剂的催化性能，以Pt-CA作为对照。4-NP加氢反应路线如下所示。
向200 µL反应管中加入126 µL超纯水、30 µL 4-NP（浓度1 mmol/L）和20 µL蛋白笼封装Pt纳米催化剂（Pt浓度5.12 μmol/L），混合均匀后加入24 µL NaBH4（浓度16 mmol/L），开始反应计时。使用酶标仪在250～500 nm处进行全波段扫描，反应总时间20 min。在25 ℃下，考察不同催化剂Pt@VCP、Pt-CA及其在不同反应温度（25、30、35、40 ℃）下对反应速率常数的影响，并计算催化反应的活化能。
4-NP、4-HP和4-AP分别在波长320、400和296 nm处具有最大吸光度。由于4-NP催化还原至中间产物4-HP的过程极短。因此，为简化计算，4-NP转化率（%）将以反应过程中4-HP在波长400 nm处吸光度的降低为标准，根据式（1）计算。4-NP还原反应遵循拟一级反应动力学，根据式（2）计算反应的表观反应速率常数（k，min-1）。根据式（3）的阿伦尼乌斯方程确定不同催化剂上的反应活化能。
式中：A0为4-HP的初始吸光度；At为反应t时4-HP的瞬时吸光度；t为反应时间，min；k为表观反应速率常数，min-1；Ea为活化能，J/mol；T为反应热力学温度，K；A是频率因子，min-1；R为理想气体常数，8.314 J/(mol·K)。
2 结果与讨论
2.1 重组菌株构建
图3为目的基因扩增和重组质粒酶切电泳图。
图3 目的基因扩增（a）和重组质粒酶切（b）电泳图
Fig. 3 Electropherograms of target gene (a) and recombinant expression vector (b)
从图3a可以看出，泳道1和2的扩增条带清晰可见，其长度约为708 bp，与预期的目的基因序列相符，表明两个目的基因均成功进行了扩增。从图3b可以看出，泳道3和4均呈现出两个条带，其长度分别与目的基因和质粒pET28a(+)相匹配，从而验证了目的基因已成功插入质粒pET28a(+)中，构建了两个重组表达载体pET28a(+)-NCP和pET28a(+)-VCP。
2.2 目标蛋白的表达
图4为通过SDS-PAGE检测的基因工程菌诱导表达CCMV CP结果。
图4 IPTG对蛋白表达的影响
Fig. 4 Effect of IPTG on protein expression
从图4可以看出，对比泳道1和泳道2，泳道3和泳道4中出现明显的相对分子质量约22.3 kDa的蛋白条带，其相对分子质量大小与CP的预测值相符，表明构建的NCP和VCP基因工程菌在IPTG的诱导下，成功表达NCP和VCP两种“弹性蛋白样多肽-CCMV融合蛋白”。另外，从目标蛋白条带的大小可以判断，VCP（泳道4）的表达量要高于NCP（泳道3）。
2.3 目标蛋白的纯化
图5为粗蛋白液通过Ni-NTA亲和层析技术纯化处理结果。
图5 NCP和VCP结合蛋白纯化的电泳图
Fig. 5 Electrophoretic diagram of purification of NCP and VCP binding proteins
从图5可以看出，经诱导表达的重组菌株产生的NCP和VCP重组蛋白均为可溶性蛋白。在亲和层析的分离纯化过程中，流穿峰中目的蛋白的含量极低；通过低浓度（50 mmol/L）咪唑洗脱部分非特异性吸附的蛋白后，使用高浓度（500 mmol/L）咪唑洗脱得到目标蛋白。通过凝胶成像系统进行扫描分析，结果显示，亲和层析纯化后的NCP（泳道4）和VCP（泳道8）蛋白纯度均＞90%。采用二喹啉甲酸法（BCA）对浓缩后的蛋白质量浓度进行测定，计算得出NCP和VCP的蛋白质量浓度分别为74和136 mg/L的发酵液。
2.4 纳米粒组装性能分析
2.4.1 pH对融合蛋白体外自组装的影响
图6为NCP、VCP组装的VLPs的SEM图和粒径分布图。
图6 NCP、VCP组装的VLPs的SEM图（a、b）及粒径分布图（c、d）
Fig. 6 TEM images (a, b) and particle distribution diagrams (c, d) of NCP assembled VLPs and VCP assembled VLPs
从图6可以看出，NCP和VCP两种融合蛋白均可自组装形成规则的球形VLPS，其平均粒径分别为(29.18±1.31)和(25.76±2.13) nm，与天然CCMV VLPs的尺寸极为接近。这一结果证明，构建的NCP和VCP融合蛋白具有pH响应的自组装能力，与天然CCMV CPs的组装条件一致。
2.4.2 NaCl浓度对融合蛋白体外自组装的影响
天然的CCMV CP在自主组装过程中表现出对pH和NaCl浓度的依赖性。在pH=7.4和高NaCl浓度（约1.0 mol/L）条件下，该蛋白呈现分解状态；而在pH=4.8和低NaCl浓度条件下，其结构则表现出高度的致密性[32]。图7、8分别为pH=4.8和7.4时，不同NaCl浓度对NCP和VCP自组装能力的影响结果。
图7 pH=4.8时NaCl浓度对NCP（a）和VCP（b）自组装能力的影响
Fig. 7 Effect of NaCl concentration on self-assembly ability of NCP (a) and VCP (b) at pH 4.8
从图7可以看出，pH=4.8时，随着NaCl浓度的增加，NCP的自组装能力不断加强（图7a）。浓度为0 mol/L时，无法通过激光粒度仪检测出VLPs，即在此条件下，NCP无法组装为VLPs；而当浓度达到0.9 mol/L时，VLPs的占比达到最大。VCP自组装性能也随着NaCl浓度的增加而提高（图7b），但不同之处在于，NaCl浓度为0 mol/L时依然有部分VCP组装成VLPs，表明VCP的自组装能力更强，受NaCl浓度的影响更小。经测定，NCP和VCP组装的VLPs粒径均约为28 nm，与TEM图结果相近，均为二十面体对称结构（T=3）。
从图8可以看出，pH=7.4时，两种融合蛋白的自组装能力与pH=4.8条件的类似。然而，只有当NaCl浓度＞1.7 mol/L时，NCP才开始自组装（图8a），而NaCl浓度＜1.7 mol/L时，VCP已能自组装成VLPs（图8b）。经测定，它们组装形成的VLPs粒子尺寸均约为18 nm，为T=1结构。
图8 pH=7.4时NaCl浓度对NCP（a）和VCP（b）自组装能力的影响
Fig. 8 Effect of NaCl concentration on self-assembly ability of NCP (a) and VCP (b) at pH 7.4
以上结果表明，与天然CCMV CP自组装条件相比，整合ELP的CCMV CP可以在中性条件和低NaCl浓度条件下实现自组装，而且疏水性较强的VCP更易实现自组装。这一特性有利于后续的催化反应中保持催化剂的稳定性。
2.4.3 温度对融合蛋白体外自组装的影响
ELP具备温度敏感性。在低温条件下，ELP展现出亲水特性；而温度一旦超过特定阈值，其性质则转变为疏水性[33]。图9为融合蛋白NCP和VCP的DSC曲线。
图9 融合蛋白NCP（a）和VCP（b）的DSC曲线
Fig. 9 DSC curves of fusion protein NCP (a) and VCP (b)
从图9可以看出，DSC升温曲线中，NCP（图9a）和VCP（图9b）融合蛋白液在22 ℃时均出现明显的吸热峰，热值分别为0.5028和0.8067 J/g，表明它们的低临界相转变温度（LCST）均为22 ℃。
低于该温度，融合蛋白结构中的ELP部分为伸展的亲水构象，而超过该温度，则转变为卷曲的疏水构象。一般来说，催化反应温度均设置在常温（25 ℃）及以上，因此，NCP和VCP融合蛋白可以形成由温度诱导的自组装蛋白笼。在较高温度下，VLP结构的稳定性增加，利用其制备的限域催化剂分散性进一步提高，有助于催化反应效率的提升。
2.5 蛋白笼封装Pt纳米催化剂的表征
图10为Pt@VCP和Pt-CA的TEM图。
图10 Pt@VCP（a）和Pt-CA（b）的TEM图
Fig. 10 TEM images of Pt@VCP (a) and Pt-CA (b)
从图10可以看出，与平均粒径为(6.07±1.38) nm的Pt-CA（图10b）相比，大部分VLPs封装的多个Pt纳米颗粒的尺寸为(3.25±0.40) nm（图10a）。经估算，Pt@VCP的封装率约为85%，其较好的封装效果主要归因于VCP的稳定性。另外，与Pt-CA相比，Pt@VCP呈高度分散状态，这有利于提高其催化活性。经ICP-OES测定，Pt@VCP和Pt-CA的Pt含量分别为0.284和0.291 g/L。
图11为Pt@VCP和Pt-CA的XPS谱图。
图11 Pt@VCP和Pt-CA的XPS谱图
Fig. 11 XPS spectra of Pt@VCP and Pt-CA
从图11a可以看出，Pt@VCP在结合能284.80、286.20、287.38、288.26、289.27 eV处的特征峰分别归属于C—C、C—N、C==N、N—C==O、O—C==O[34-35]；Pt-CA在结合能284.80、286.46、288.19、289.19 eV处的特征峰分别归属于C—C、C—O、C==O、O—C==O。
从图11b可以看出，在结合能398.04、399.73、400.93 eV处显示出3个特征峰，分别对应Pt@VCP的C==N、C—N、N—H[36-37]。在Pt-CA中并未检测出N相关基团。
从图11c可以看出，Pt@VCP和Pt-CA中的Pt均存在两种价态，分别是Pt0和Pt2+。Pt@VCP在结合能73.61和70.36 eV处的两个峰分别为Pt0的Pt 4f5/2、Pt 4f7/2[38]。结合能75.09和71.85 eV处的峰分别对应Pt2+的Pt 4f5/2、Pt 4f7/2。与Pt-CA相比，Pt@VCP中的Pt0分布更高（约占71.3%），Pt0的存在可以为催化反应提供高效的活性位点。Pt@VCP的Pt0 4f7/2结合能为70.36 eV，比Pt-CA的（71.12 eV）低0.76 eV。表明与Pt-CA相比，Pt@VCP的Pt 4f向低结合能方向发生了偏移，可能是由于Pt纳米颗粒和VCP之间相互作用促进了金属-载体之间的电子转移。N原子外层的孤对电子能够为金属纳米颗粒提供锚定位点，并具有转移至Pt纳米颗粒的能力，导致Pt外层电子的结合能下降，从而提高催化反应速率。
2.6 催化加氢性能分析
4-NP加氢反应机理较为清楚，被广泛用于金属纳米颗粒和复合纳米催化剂的催化性能评价[39-41]。底物4-NP在波长320 nm处有最大吸光度。反应开始后，4-NP迅速被加氢还原为中间产物4-HP，最大吸收波长从320 nm移至400 nm。接着，反应中间产物4-HP进一步被加氢还原为4-AP。此过程中检测的最大吸收波长从400 nm移至296 nm。图12a为Pt@VCP催化加氢还原4-NP反应的全波长扫描实时数据。
图12 Pt@VCP催化加氢还原4-NP反应结果
Fig. 12 Results of Pt@VCP for catalytic hydrogenation of 4-NP
从图12a可以看出，由于第一步反应迅速，反应起始未在320 nm检测出底物4-NP的吸光度，而4-HP在400 nm的吸光度随反应的进行逐渐减小，产物4-AP在296 nm的吸光度持续上升，表明在催化剂Pt@VCP的作用下，4-NP还原反应持续进行。
图12b为Pt@VCP催化下4-NP转化率随时间的变化。
从图12b可以看出，反应进行12 min时，Pt@VCP催化作用下4-NP转化率约88%，而相同条件下，Pt-CA催化作用下4-NP转化率仅为52%。
图12c为Pt@VCP催化4-NP加氢反应的拟一级动力学反应拟合曲线。
从图12c可以计算得出，Pt@VCP催化4-NP加氢反应的k为0.17 min-1，是Pt-CA催化4-NP加氢反应（k=0.06 min-1）的2.8倍。这是因为，Pt@VCP的限域效应使其在催化加氢反应中表现出高活性，一方面，限域结构内部的Pt纳米颗粒尺寸较小，这有助于保持其良好的分散性和稳定性；另一方面，限域结构使4-NP的有效浓度高于溶液本体，可以显著提高4-NP与催化剂活性中心的接触几率，从而加快反应进程[42-44]。
图13a为不同温度下Pt@VCP催化4-NP加氢反应的拟一级动力学反应拟合曲线。
图13 不同温度下Pt@VCP催化4-NP加氢反应的拟一级动力学反应拟合曲线（a）；Pt@VCP和Pt-CA催化4-NP加氢反应的阿伦尼乌斯方程的拟合曲线（b）
Fig. 13 Pseudo-first-order kinetic reaction fitting curves of 4-NP hydrogenation catalyzed by Pt@VCP at different temperatures (a); Fitting curves of Arrhenius equation for 4-NP hydrogenation catalyzed by Pt@VCP and Pt-CA (b)
从图13a可以看出，随着温度的上升，Pt@VCP催化4-NP加氢反应的反应速率不断提高，经计算，反应温度从25 ℃升高到40 ℃时，Pt@VCP催化4-NP加氢反应的k由0.13 min-1提高至0.19 min-1。
图13b为Pt@VCP和Pt-CA催化4-NP加氢反应的阿伦尼乌斯方程的拟合曲线。
从图13b可以计算得出，Pt@VCP催化4-NP加氢反应的活化能为14.1 kJ/mol，低于Pt-CA催化4-NP加氢反应的活化能（22.0 kJ/mol）。这可能是因为，Pt纳米颗粒、底物4-NP与VLP内表面相关功能基团（—NH2、—OH等）之间的相互作用降低了反应的能垒。
综上，相较于非负载型Pt-CA催化剂，Pt@VCP在催化4-NP加氢反应中，由于限域效应导致反应活化能降低，进而提升了催化活性。
3 结论
结合ELP构建了一种功能纳米颗粒体系，通过在CCMV CP的N端引入ELP，实现了结构功能化，并在E. coli BL21成功表达NCP和VCP。在pH、NaCl浓度和温度等多重响应条件下，NCP和VCP自组装成稳定的VLPs，并有效封装Pt纳米颗粒。进行了催化4-NP的还原反应性能测试。
（1）NCP和VCP两种融合蛋白均成功组装成球形VLPs，其平均粒径分别为(29.18±1.31)和(25.76±2.13) nm；pH=4.8时，VCP可以在没有NaCl的条件下，自组装成的VLPs，当pH=7.4时，NaCl浓度＜1.7 mol/L时，VCP也能自组装成的VLPs。Pt@VCP的封装率约为85%。
（2）Pt@VCP催化4-NP加氢反应的表观反应速率常数为0.17 min-1，是Pt-CA催化4-NP加氢反应的2.8倍；活化能为14.1 kJ/mol。
（3）Pt@VCP催化4-NP加氢反应的高活性原因可归结于，纳米笼的限域效应以及底物4-NP、Pt纳米颗粒与VLPs内表面功能基团之间的协同作用。
本文不仅可以为蛋白笼限域催化剂的设计与开发提供新的视角，还可以为可持续化学转化和绿色催化过程的应用提供实验基础。
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