当归〔Angelica sinensis (Oliv.) Diels〕为伞形科植物，干燥根具有补血、活血、调经止痛、润肠通便等功效，其重要活性成分为当归多糖，具有抗氧化、调节免疫力、抗肿瘤及抗辐射等活性[1]。当归多糖相对分子质量(简称分子量）大且糖链结构比较复杂，水溶液具有一定的黏稠性，影响其作为静脉给药的应用及生物利用率，也影响其质量评价、控制和作用机理的探讨[1-3]。近年来，多糖受体理论研究表明，活性多糖在与嵌入细胞质膜中的受体结合过程中，发挥药效的部分仅是活性多糖中的一个小分子片段，活性多糖中有可能存在特定的活性中心，且分子量较小的多糖溶解性好，更易进入生物体内发挥药理作用[3]。VIEIRA 等[2]研究发现，分子量较大的植物多糖水解成较小的低聚糖或寡糖可以增强其抗氧化性能。QIAO 等[4]研究表明，分子量较小的蓝莓果胶多糖(BP-1 和BP-2）展现出更强的自由基清除活性。目前，有关当归多糖的研究多集中在大分子当归多糖结构及其药理活性方面[1]。

人体内存在大量的自由基，其化学性质极为活泼，具有强烈的脂质过氧化作用，对人体健康危害较大[5]。抗氧化物可以阻止自由基的产生或灭活自由基，消除自由基引起的损伤。人体皮肤受到紫外线等因素刺激时，会增强体内黑色素细胞中酪氨酸酶(又名双功能多酚氧化酶）的活性，进而催化两个氧化反应。首先，酪氨酸会在酪氨酸酶的催化下生成大量的L-多巴，此时酪氨酸酶表现出酪氨酸酶单酚酶的催化活性；然后，L-多巴在酪氨酸酶的作用下脱氢完成转化为多巴醌，此时，酪氨酸酶表现出酪氨酸酶二酚酶活性；最后，多巴醌在体内进行一系列反应而堆积并形成黑色素[6]。若能抑制黑色素合成的关键性酶，即酪氨酸酶的活性，则可抑制黑色素细胞产生黑色素实现皮肤美白，CHEN 等[7]研究发现，白芨多糖对黑色素瘤细胞的增殖活性具有显著的抑制作用和抗氧化活性。本课题组[8-9]前期研究也表明，红芪多糖和党参多糖均具有良好的美白、吸湿和保湿活性。

余钰骢等[10]对灵芝结构多糖进行水解，得到具有清除自由基功能的结构多糖水解产物。张洪涛等[11]报道了基于电喷雾电离-碰撞诱导解离-串联质谱(ESICID-MS/MS）离子碎片峰特征的香菇多糖水解机制，以及系列香菇寡糖的制备。PI 等[12]研究发现，通过酶水解结合冷冻干燥技术，从海带中提取的海带多糖(KPS-EF）具有体外抗病毒活性。目前，酸剪切后的当归多糖片段及其活性鲜见报道。

本文在单因素实验基础上，采用响应面技术[13]对当归多糖(Angelica sinensis polysaccharide 简写为ASP）的酸剪切条件进行筛选，得到总抗氧化性能较强的当归多糖片段。利用柱层析法对酸剪切后的当归多糖分子片段混合物进行分离纯化，通过UV-Vis、FTIR、HPGPC、HPLC、SEM、TGA 等对当归多糖片段进行结构表征，并对其抗氧化、美白、吸湿和保湿活性进行考察，得到综合性能良好的当归多糖片段。以期作为吸湿保湿剂，应用于食品、化妆品和医药领域。该研究可为当归植物资源的二次开发和当归多糖的利用提供理论依据。

1 实验部分

1.1 材料、试剂与仪器

当归购自甘肃岷县，经西北民族大学化工学院师永清教授鉴定为伞形科植物当归〔Angelica sinensis(Oliv.)Diels〕的干燥根。

葡萄糖(Glc）、甘露糖(Man）、鼠李糖(Rha）、葡萄糖醛酸(GlcA）、半乳糖醛酸(GalA）、半乳糖(Gal）、木糖(Xyl）、核糖(Rib）、阿拉伯糖(Ara）(以上质量分数均为98%）、L-酪氨酸(质量分数99.00%）、DEAE-52 纤维素、Sephadex-G100 葡聚糖凝胶，北京索莱宝科技有限公司；聚乙二醇(PEG，数均分子量1510、3800、6250、14600、29450），中国检验认证(集团）有限公司；苯酚，AR，天津市河东区红岩试剂厂；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH，质量分数98.5%），2,2'-联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐(ABTS）、水杨酸，AR，上海麦克林生化科技股份有限公司；焦性没食子酸(质量分数98%），天津市凯通化学试剂有限公司；硫酸亚铁，AR，天津市百世化工有限公司；磷酸盐缓冲液(PBS，0.1 mol/L，pH=6.7），乙腈(质量分数99.9%），天津市光复科技发展有限公司；苯乙基间苯二酚、L-多巴(质量分数98%）、酪氨酸酶(25 kU，生物纯，500 U/mg），上海源叶生物科技有限公司。其余试剂均为市售分析纯。

800A 多功能粉碎机，永康市红太阳机电有限公司；SHA-BA 型水浴恒温振荡器，上海巨纳科技有限公司；UV-6100 型紫外-可见分光光度计(UV-Vis），上海美谱达仪器有限公司；DL-720D 型数控超声波清洗器，上海之信仪器有限公司；具砂板四氟节门层析柱(40 mm×450 mm、25 mm×450 mm），北京欣维尔玻璃仪器有限公司；Satellite 5000 型傅里叶变换红外光谱仪(FTIR），美国 Thermo Fisher Scientific 公司；Waters e2695 型高效液相凝胶色谱仪(HPGPC），美国Waters 公司；SU8000 型场发射扫描电子显微镜(SEM），日本Hitachi 公司；Agilent 1200 型高效液相色谱仪(HPLC），美国Agilent 公司；TG 209 F3 型热重分析仪(TGA），德国Netzsch公司。

1.2 方法

1.2.1 当归多糖提取

将当归干燥根洗净、干燥、粉碎后，按料液比(g∶mL）1∶10 加入无水乙醇，于65 ℃下回流除脂3 次，每次时间分别为2.0、1.0 和0.5 h。经抽滤收集固体，在室温下干燥24 h，得到浅棕黄色除脂当归粉末，待用[14]。

采用超声辅助水提醇沉法[14-15]提取当归粗多糖。首先，将除脂当归粉末200.00 g 倒入烧杯中，按料液比(g∶mL）1∶15 加入超纯水，升温至65 ℃，搅拌(190 r/min）超声(99 W），过滤，收集滤液，离心，取上清液，经0.45 μm 水性滤膜抽滤。按上述步骤提取，一共提取3 次，提取时间分别为1.5、1.0 和0.5 h，合并滤液，减压蒸馏至总体积的1/5，冷却至室温，缓慢搅拌下加入无水乙醇沉淀，乙醇体积分数为85%，于4 ℃密封静置12 h，过滤，收集沉淀，室温干燥24 h。采用上述相同的方法提取11 次，共得到黄色粉末状当归粗多糖632.05 g。

采用Sevage 试剂[15]〔V(氯仿)∶V(正丁醇)＝4∶1〕对上述得到的当归粗多糖除蛋白，再经无水乙醇沉淀、过滤、25 ℃ 真空干燥12 h。重复上述过程，得到147.87 g 淡黄色粉末状精制ASP。

参照文献[16]方法测定多糖含量。以葡萄糖为标准品，绘制葡萄糖质量浓度(x）-吸光度(y）标准曲线，得到拟合标准曲线回归方程为 y=14.194x+0.0345(R2＝0.9995），x 在0 ～0.20 g/L 时的线性关系良好。量取2.00 mL 当归多糖样品水溶液，以苯酚-硫酸法显色(质量分数5%的苯酚溶液1.00 mL 和质量分数95% ～98%浓硫酸5.00 mL），采用UV-Vis 测定当归多糖样品水溶液于490 nm 处的吸光度(A490），再根据上述标准曲线回归方程计算，得到当归多糖的质量浓度，再根据式(1）计算当归多糖的提取率：

式中：Y 为当归多糖的提取率，%；ρ 为当归多糖样品溶液的质量浓度，g/L；V 为当归多糖样品溶液的定容体积，mL；n 为稀释倍数；m 为当归粉末质量，mg。

1.2.2 当归多糖的剪切

将2.00 g ASP 和20.00 mL 不同剪切试剂(HCl、H2SO4、Cl3CCOOH、NaOH）加入到50 mL 三颈烧瓶中，在N2 保护下升温至回流温度，达到预设时间后，冷却至室温，用质量分数20%的NaOH 溶液或10%的稀盐酸将剪切液调至pH＝7，在截留分子量为1500 的透析袋中透析(长流自来水透析24 h 后，每隔3 h 换超纯水透析3 次，水透析至检测不到氯离子为止，下同）、真空浓缩至原体积的1/5、无水乙醇沉淀、过滤、25 ℃真空干燥12 h，得到当归多糖剪切片段混合物。

1.2.3 当归多糖酸剪切分子片段的分离纯化

将盐酸剪切当归多糖分子片段通过DEAE-52纤维素柱(40 mm×450 mm）分离[17]，用超纯水和不同浓度(0.05、0.10、0.20 mol/L）的NaCl 水溶液依次洗脱，收集洗脱液(图1），经透析(分子量1500）、浓缩至总体积1/20、加入无水乙醇至其体积分数达90%(下同），过滤、25 ℃真空干燥12 h，得到4种不同分子量的当归多糖酸剪切片段(粗ASP-1a、粗ASP-2a、粗ASP-3a、粗ASP-4a），再分别采用Sephadex-G100 葡聚糖凝胶柱(25 mm×450 mm）对上述样品进行纯化，超纯水洗脱，收集洗脱液，浓缩、醇沉、过滤、25 ℃真空干燥12 h，得到4 种当归多糖酸剪切片段，分别记为ASP-1a、ASP-2a、ASP-3a、ASP-4a。

1.2.4 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）衍生化

混合单糖对照品：分别称取单糖对照品 Man 1.60 mg、Rha 2.30 mg、GlcA 1.40 mg、GalA 1.20 mg、Glc 2.10 mg、Gal 1.30 mg、Xyl 1.50 mg、Rib 1.80 mg、Ara 1.10 mg，加超纯水溶解，转移至容量瓶中定容，对混合单糖对照品进行PMP 衍生化处理[18]，备用。

酸剪切多糖分子片段：分别准确称取5.00 mg的ASP-1a、ASP-2a、ASP-3a 和ASP-4a，各自加入消解管中，加入1.00 mL 浓度为2.00 mol/L 的三氟乙酸，氩气保护，于110 ℃ 恒温箱中反应5 h，冷却至室温，真空浓缩至干后加入甲醇500 μL，溶解后再挥干，重复3 次，除去三氟乙酸后，转移至10 mL容量瓶中，超纯水定容，备用。同混合单糖对照品PMP 衍生化方法，制备ASP-1a、ASP-2a、ASP-3a和ASP-4a 的PMP 衍生化供试液，备用。

1.3 表征与测试

FTIR 测试：用KBr 压片法，波数范围4000 ～500 cm–1，分辨率4 cm–1[19]；SEM 测试：将5 mg 样品喷金处理，低位二次电子(LEI）模式，工作电流20 μA，电子加速电压20.0 kV；TGA 测试：氮气气氛，流速5 mL/min，升温速率10 ℃/min，温度范围30 ～800 ℃；UV-Vis 测试：将样品溶解在超纯水中，配制成质量浓度为1.0 g/L 的样品溶液，在200 ～400 nm范围内全波长扫描。

多糖分子量测定(HPGPC）：色谱柱Ultrahydrogel TM 6 mm× 40 mm Guard Colum，柱温35 ℃，流动相为浓度0.20 mol/L NaNO3 的PBS 溶液[20]，以质量分数20% NaOH 调节pH=9.0，流速1.00 mL/min，以分子量为1510、3800、6250、14600、29450 的PEG 为标准样品，对聚合物的分子量进行校正，以标准品保留时间(tR）为x 轴，标准品分子量的对数(lg Mw）为y 轴，绘制标准曲线，经拟合得到标准曲线方程为：y=–0.6445x+10.866，R2＝0.9995。

单糖组成分析条件(HPLC）：Zorbax Eclipse XDB-C18 150 mm×4.6 mm×5 μm 色谱柱，流动相为PBS(0.10 mol/L，pH=6.7）和乙睛以体积比83∶17 组成，流速1.00 mL/min，进样量20 μL，在250 nm下进行检测。

1.4 抗氧化性能测试

将ASP、ASP-1a、ASP-2a、ASP-3a、ASP-4a分别配制成5 个质量浓度(50、100、150、200、250 μg/mL）的去离子水溶液，用于以下实验。

1.4.1 DPPH 自由基（DPPH•）清除率[21]

分别精确量取上述2.00 mL 样品溶液于试管中，加入2.00 mL 的DPPH 溶液(0.10 mmol/L）混匀，暗环境反应30 min，用UV-Vis 测定溶液在517 nm 处的吸光度。以维生素C(VC）为阳性对照，平行3 次实验，根据式(2）计算DPPH•清除率。

式中：A0 和A1 分别为蒸馏水(阴性对照）和样品的吸光度。

1.4.2 ABTS 阳离子自由基（ABTS+•）清除率[22]

分别精确量取上述2.00 mL 样品溶液于试管中，加入6.00 mL 的ABTS+•溶液(分别量取7 mmol/L 的ABTS 溶液10.00 mL 和140 mmol/L 过硫酸钾176 μL，在暗环境下混匀放置24 h，测定在734 nm 处的吸光度为0.70±0.02）；采用UV-Vis 测定相同波长下的吸光度。VC 为对照，平行3 次实验。根据式(2）计算ABTS+•清除率。

1.4.3 •OH 清除率[23]

分别精确量取上述1.00 mL 样品溶液于试管中，分别加入1.00 mL 的FeSO4 溶液(9 mmol/L）、1.00 mL水杨酸溶液(9 mmol/L），最后加入1.00 mL 的H2O2，充分振荡，于37 ℃反应30 min，用UV-Vis 测定510 nm 处的吸光度。以VC 为阳性对照，平行3 次实验。根据式(2）计算•OH 清除率。

1.4.4 •O2-清除率[24]

分别精确量取上述1.00 mL 不同质量浓度的样品溶液于试管中，依次加2.00 mL 的PBS、250 μL邻苯三酚溶液(35 mmol/L），摇匀，于25 ℃反应5 min，加入200 μL 0.10 mol/L 盐酸，反应结束后，用UV-Vis测定溶液在560 nm 处的吸光度。以VC 为阳性对照，平行3 次实验。根据式(2）计算•O2-清除率。

1.5 单因素实验

按照1.2.2 节进行当归多糖剪切单因素实验，考察剪切试剂浓度 (0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mol/L）、时间(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h）、温度(50、60、70、80、90 ℃）和剪切试剂类型 (H2SO4、Cl3CCOOH、HCl、NaOH）4 个单因素对当归多糖剪切片段的总抗氧化活性的影响。考察其中一个变量时，其他3个量以剪切试剂浓度0.15 mol/L、剪切时间1.5 h、温度70 ℃和剪切试剂HCl 为准。按式(3）计算总抗氧化活性。

式中：A、B、C、D 分别为DPPH•、ABTS+•、•OH、•O2-的清除率。

1.6 响应面实验

根据单因素实验结果，以温度(X1）、时间(X2）、剪切试剂浓度(X3）作为自变量，以当归多糖剪切片段的总抗氧化活性(Y）为评价指标，根据响应面实验设计原理，对3 个因素分别设置3 个水平，用“–1、0、+1”表示温度、时间、剪切试剂浓度根据单因素实验结果中心点取值。响应面实验因素水平的设计见表1。

1.7 酪氨酸酶抑制性能测试

参考文献[25]方法并稍加修改。按表2 分别在编号为D1、D2、D3、D4 的试管中移取相应量样品的去离子水溶液(质量浓度梯度为0、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 g/L）、PBS 缓冲液(0.10 mol/L，pH=6.7）及酪氨酸酶溶液(浓度为50 U/mL），低温加热10 min，于4 支试管中分别加入1.5 mmol/L 的L-酪氨酸溶液(单酚酶）和1.0 mmol/L 的L-多巴溶液(二酚酶），于37 ℃下反应15 min，用UV-Vis 测定4 组溶液在475 nm 处的吸光度(分别记为A1、A2、A3 和A4）。以苯乙基间苯二酚为对照，平行测定3 次，根据式(4）计算酪氨酸酶清除率(%）。

酪氨酸酶清除率/%=[1–(A1–A2)/(A3–A4)]×100(4）

1.8 吸湿和保湿性能测试

20 ℃下，以甘油作为对照，测定ASP 与ASP-1a、ASP-2a、ASP-3a、ASP-4a 在两种密闭环境中(饱和碳酸钾溶液的相对湿度43%、饱和氯化钾溶液的相对湿度83%，下同）的吸湿率。将样品于60 ℃干燥24 h 后，质量记为m1(g），然后将样品置于恒温恒湿的密闭容器中，分别在2、4、6、8、10、12 h 时称重，记为m2(g）。根据式(5）计算吸湿率(%）。

分别将对照品甘油、ASP、ASP-1a、ASP-2a、ASP-3a、ASP-4a 用去离子水配制成质量浓度为500 μg/mL 的溶液，测定样品溶液在上述两种密闭环境中的保湿率。测试前分别称取样品溶液记作m3(g），置于恒温恒湿的密闭容器中，在2、4、6、8、10、12 h 时称重，记为m4(g）。根据式(6）计算保湿率。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果

图2 为各单因素(剪切试剂种类、温度、时间和剪切试剂浓度）对当归多糖剪切片段总抗氧化活性的影响。

从图2a 可以看出，在70 ℃、0.15 mol/L 的不同剪切试剂剪切1.5 h 得到的当归多糖片段的总抗氧化活性从大到小排序为：HCl>H2SO4>NaOH>Cl3CCOOH，因此，选择HCl 溶液为剪切试剂进行后续实验。

从图2b 可以看出，随着温度的升高，0.15 mol/L盐酸剪切1.5 h 的当归多糖片段的总抗氧化活性呈先增长后下降的趋势。当温度为80 ℃，当归多糖酸剪切片段溶液质量浓度为0.6 mg/L 时，总抗氧化活性最高，为30.23%。温度过高时，当归多糖酸剪切的分子更小，且部分结构会被氧化，导致抗氧化活性降低。因此，最佳的酸剪切温度为80 ℃。

从图2c 可见，随着剪切时间的延长，当归多糖酸剪切片段的总抗氧化活性呈现先增长后下降的趋势。当剪切时间为1.5 h，当归多糖酸剪切片段溶液质量浓度为0.6 mg/L 时，总抗氧化活性最高，为30.49%。当继续延长剪切时间时，当归多糖酸剪切的分子更小，且存在被氧化现象，导致其抗氧化活性降低。因此，最佳的酸剪切时间为1.5 h。

从图2d 可见，随着HCl 浓度的增加，当归多糖剪酸切片段的总抗氧化活性呈现先增长后下降的趋势。当盐酸浓度为0.15 mol/L，当归多糖酸剪切片段溶液质量浓度为0.6 mg/L 时，总抗氧化活性最高，为30.09%。当HCl 浓度继续增加时，当归多糖酸剪切分子更小，并存在被氧化现象，导致其抗氧化活性降低。因此，剪切试剂HCl 的最佳浓度为0.15 mol/L。

2.2 响应面实验优化结果

2.2.1 响应面实验结果

采用Design-Expert 10.0.7 软件，对表3 中的数据进行二项式拟合，并对模型进行方差分析，得到二项式拟合方程为：

2.2.2 模型拟合与方差分析

表4 为方差分析结果。

从表4 可以看出，模型回归F 值为272.50，P＜0.0001，表现为二次多项式模型极显著，失拟误差P=0.6985(P>0.05），表现为不显著，表明该回归方程有效，具有统计学意义。回归方程中一次项X1、X2 和X3(P＜0.05）的影响显著，交互项X1X2、X1X3、X2X3 和二次项X12、X22 及X32(P＜0.0001）的影响极显著。二次回归模型的方差分析得到相关系数R2=0.9986，表明该模型的可靠程度较高，与实验结果拟合较好。变异系数(CV）为1.01%，表明实验值具有准确性和可靠性。由表4 中变量(X1、X2 和X3）的F 值(6.05、6.79、7.80）可知，3 个因素中对当归多糖剪切片段的总抗氧化活性的影响大小排序为：X3>X2>X1。

2.2.3 响应面分析

采用Design-Expert 10.0.7 软件绘制当归多糖剪切片段的总抗氧化活性与温度、时间以及剪切试剂浓度之间的三维曲面图，结果如图3 所示。

从图3 可以看出，三维曲面图呈现出屋顶形式，表明该模型在实验变量范围内的可行性，可以确定响应值与因素之间的最优关系。屋顶的顶点是优化后较佳的工艺条件[25]。通过响应面软件分析，得到当归多糖酸剪切优化工艺条件为：温度80.84 ℃、时间1.51 h、HCl 浓度0.15 mol/L，在此条件下当归多糖剪切片段的总抗氧化活性为29.96%。

2.2.4 工艺验证结果

为验证响应面预测得到的工艺条件的可靠性，将预测得到的较佳工艺条件进行微调：HCl 浓度0.15 mol/L、时间1.5 h、温度80 ℃，在此条件下进行3 次平行实验，得到当归多糖酸剪切片段的总抗氧化活性为29.87%±0.30%，相对标准偏差(RSD）为1.68%。实验结果与预测值(29.96%）接近，说明该模型可靠，优化条件是可行的。

2.3 表征结果

2.3.1 UV-Vis 分析

图4 为ASP-1a、ASP-2a、ASP-3a 和ASP-4a 的UV-Vis 谱图。从图4 可以看出，上述多糖片段在250 和300 nm 处没有明显的吸收峰，表明其几乎不含有核酸和蛋白质[26]。

2.3.2 HPGPC 分析

图5 为ASP-1a、ASP-2a、ASP-3a 和ASP-4a 的HPGPC 谱图。

从图5 可以看出，上述多糖片段的HPGPC 谱图色谱峰均为单一的对称峰，保留时间分别为11.360、11.045、18.583、11.315 min，表明它们的纯度均较高。计算得到相应的重均分子量(Mw）分别为19014、28624、4722、20354；数均分子量(Mn）分别为14109、28575、1677、17638；分子量分散度(Mw/Mn）分别为1.35、1.00、2.82、1.15。

2.3.3 HPLC 分析

图6 为混合单糖标准品和4 种多糖片段的PMP衍生物的HPLC 谱图。

根据单糖标准品的保留时间，可以确定4 种多糖片段的单糖组成，采用外标法可以确定单糖组分物质的量之比。样品的HPLC 谱图见图6。

从图6 可见，ASP-1a 由Glc、Man 和Rha 组成，物质的量之比分别为550∶3.49∶3.18(图6b）；ASP-2a 由Man、Glc、Gal 和Ara 组成，物质的量之比为0.03∶280∶0.28∶0.17(图6c）；ASP-3a 由Man、Glc、Gal 和Ara 组成，物质的量之比为5.16∶509.42∶35.73∶6.30(图6d）；ASP-4a 由Man 和Glc 组成，物质的量之比为0.03∶279(图6e）。表明4 种多糖酸剪切片段的单糖组成均以Glc 为主，且都含有少量的Man，其中ASP-1a 还含有少量的Rha，其余3 种片段不含Rha；ASP-2a 和ASP-3a 单糖组成相同，但物质的量之比不同；ASP-4a 仅由Glc 和Man 组成。4 种多糖片段结构组成的差异可能会导致其药理活性有所不同。

2.3.4 FTIR 分析

图7 为ASP-1a、ASP-2a、ASP-3a 和ASP-4a 的FTIR 谱图。

从图7 可以看出，3600 ～3200 cm–1 处为多糖分子中的O—H 伸缩振动吸收峰；3020 ～2820 cm–1 处为C—H 的伸缩振动吸收峰；1200 ～950 cm–1 处吸收峰为C—O—C 和C—O—H 的伸缩振动[27]。纯化后的ASP-1a、ASP-2a、ASP-3a 和ASP-4a 在3432 cm–1处存在强吸收峰，为O—H 的伸缩振动；在2928 cm–1处的弱振动峰为饱和碳原子上的C—H 伸缩振动，与指纹区1416 cm–1 处C—H 的弯曲振动吸收峰相互佐证[28]，这些均为多糖的特征峰[29]；1200 ～1000 cm–1的吸收峰可归因于环振动与C—OH 侧基的伸缩振动和C—O—C 糖苷键伸缩振动重叠，表明存在吡喃糖[30]。ASP-2a 和ASP-3a 在1035 cm–1 处存在强吸收峰，表明两者含有吡喃糖。

2.3.5 SEM 分析

图8 为ASP-1a、ASP-2a、ASP-3a、ASP-4a 和ASP 的SEM 图。

从图8 可以看出，4 种多糖片段和ASP 的结构在大小和形状上存在明显的差异[31]。ASP-1a 表面崎岖不平，呈断崖状分布，有细小孔洞(图8a）；ASP-2a表面较为平整致密，有细小孔洞(图8b）；ASP-3a表面凹凸不平呈波浪状，内部有孔径交错分布(图8c）；ASP-4a 表面具有不规则凸起，内部呈致密的网状结构(图8d），有助于锁住水分；ASP 呈表面不规则分布，大量明显孔洞呈不规则分布(图8e）。

2.3.6 TGA 分析

图9 为ASP-1a、ASP-2a、ASP-3a 和ASP-4a 的TG 和DTG 曲线。

从图9 可以看出，4 种多糖片段的质量均随着温度的上升而减少，多糖质量损失大致可分为2 个阶段。第一阶段(30 ～200 ℃）的多糖质量损失率并不明显，其质量损失率分别为7.87%、8.40%、13.10%和13.64%，此阶段主要是由自由水和有机挥发性物质快速蒸发引起的，因此质量损失率较小[32]，表明4 种多糖片段在100 ℃内的稳定性较好。第二阶段(200 ～800 ℃）的多糖质量均急剧下降，其质量损失率分别为69.33%、75.95%、70.61%和61.94%，主要是由于高温导致多糖热降解，发生糖苷键断链[33]。4种多糖片段的的最终残留质量分数分别为22.33%、15.08%、15.84%和24.25%。

2.4 抗氧化性能分析

图10 为不同质量浓度的ASP-1a、ASP-2a、ASP-3a、ASP-4a 和ASP 对4 种自由基的清除率测试结果。

图10 表明，4 种多糖片段和ASP 的质量浓度为50 ～250 μg/mL 时，随着它们质量浓度的增加，对4种自由基的清除率逐渐升高，呈剂量依赖性，但均低于对照品VC。

当上述5 种样品的质量浓度为250 μg/mL 时，它们对DPPH•的清除率高低排序为：ASP-1a>ASP-4a>ASP-2a>ASP-3a>ASP，半数抑制质量浓度(IC50）分别为679.86、748.89、784.22、723.58、891.43 μg/mL(图10a）；对 ABST+•清除率高低排序为：ASP-1a>ASP-4a>ASP-2a>ASP-3a>ASP，IC50 分别为381.18、428.12、457.81、393.72、523.39 μg/mL(图10b）；对•OH 清除率高低排序为：ASP-2a＞ASP-1a>ASP-4a>ASP-3a>ASP，IC50 分别为914.20、906.55、1143.75、997.02、1556.16 μg/mL(图10c）；对•O2–的清除率高低排序为：ASP-1a>ASP-4a>ASP-2a>ASP-3a>ASP，IC50分别为644.87、665.79、687.84、665.38、980.77 μg/mL(图10d）。

综合ASP-1a、ASP-2a、ASP-3a、ASP-4a 和ASP对4 种自由基的清除率结果可以看出，酸剪切可以提高当归多糖片段对4 种自由基清除能力，增强其抗氧化性能。

结合分子量测试结果(图5），Mw=19000 ～20000的当归多糖片段对DPPH•、ABTS+•、•O2-的清除能力较强，Mw 过高或过低对上述自由基的清除能力均有所下降，而Mw 大小对当归多糖片段的•OH 的清除率影响不大。ASP-1a 的Mw(19014）大小适中，且4 种多糖片段中，只有ASP-1a 结构中含有Rha，其30 ～200 ℃时的质量损失率(7.87%）最低，表明ASP-1a 的稳定性更好，更有利于自由基的清除。

2.5 美白活性分析

图11 为不同质量浓度的ASP-1a、ASP-2a、ASP-3a、ASP-4a 和ASP 对酪氨酸酶的清除率测试结果。

图11a 显示，在2 ～10 g/L 的质量浓度范围内，上述样品均表现出对酪氨酸酶单酚酶的抑制作用，但均低于对照品(苯乙基间苯二酚）的抑制能力。随着样品质量浓度的增加，它们对酪氨酸酶单酚酶的清除率均呈增长趋势，清除率与质量浓度呈线性关系。当质量浓度为10 g/L 时，清除率高低排序为：ASP-1a>ASP-2a>ASP-3a>ASP-4a>ASP，IC50 分别为6.78、7.05、7.12、7.42、10.93 g/L，表明多糖样品均具有美白活性，其中，ASP-1a 的美白活性最强。

由图11b 可以看出，在2 ～10 g/L 的质量浓度范围内，上述样品均表现出对酪氨酸酶二酚酶的抑制作用，但均低于对照品(苯乙基间苯二酚）的抑制能力。随着样品质量浓度的增加，它们对酪氨酸酶二酚酶的清除率均呈增长趋势，清除率与质量浓度呈线性关系。当质量浓度为10 g/L 时，清除率高低排序为ASP-2a>ASP-1a>ASP-3a> SP-4a>ASP，IC50 分别为10.81、10.97、11.42、12.34 和15.20 g/L。

综合以上结果可知，酸剪切后的当归多糖片段对酪氨酸酶单酚酶、二酚酶清除能力皆有所提高，且对酪氨酸酶单酚酶的清除率高于酪氨酸酶二酚酶。

酸剪切当归多糖片段较未酸剪切总多糖有更好的美白作用，可以抑制酪氨酸酶单酚酶和二酚酶的活性，虽然其美白活性均弱于对照品苯乙基间苯二酚，但苯乙基间苯二酚可能会刺激皮肤，出现红斑、丘疹、皮肤瘙痒等症状[34]。而当归多糖片段天然、绿色，可作为美白剂用于化妆品行业。

2.6 吸湿保湿活性分析

图12 为ASP-1a、ASP-2a、ASP-3a、ASP-4a 和ASP在20 ℃、不同相对湿度环境中的吸湿和保湿能力测试结果。

图12a 显示，在20 ℃、相对湿度43%的环境中，上述样品12 h 的吸湿率排序为：ASP(109.08%）>ASP-4a (108.12%）>ASP-3a(107.86%）>ASP-1a(107.68%）>ASP-2a(107.61%），均高于对照品甘油的吸湿率(105.08%），表明ASP 和4 种多糖酸剪切片段吸湿率相差不大，均>107.00%。

图12b 显示，在20 ℃、相对湿度83%的环境中，上述样品12 h 的吸湿率相差不大，均>143.00%，ASP的吸湿率最高，为148.26%，略低于对照品甘油的吸湿率(150.28%）。可能是ASP 的分子链长，含有大量的羟基，同时结合SEM 图(图8）可以看出，ASP表面崎岖不平，且有大量不规则分布的孔洞，增大了空气中的水分子与多糖接触的比表面积，增加了多糖分子中的羟基与空气中水分子间形成氢键的能力，且细小孔洞也有助于锁住水分。综合来看，两种相对湿度环境中，ASP 吸湿性均更强。

图12c 显示，在20 ℃、相对湿度43%的环境中，12 h 时所有样品的保湿率均>99.40%，表现出良好的保湿效果。其中，ASP-4a 保湿率(99.80%）高于对照品甘油(99.75%）。

图12d 显示，在20 ℃、相对湿度83%的环境中，12 h 时所有样品的保湿率均保持在99.80%以上，表现出优异的保湿性能，与对照品甘油相差不大(99.98%）。其中，多糖片段 ASP-4a 的保湿率(99.95%）最优，结合SEM 图(图8），ASP-4a 表面具有不规则凸起，内部呈致密的网状结构，有助于锁住水分。

通常，人体较为舒适的相对湿度为40% ～60%，而甘油受环境湿度影响较大，当空气干燥时会从皮肤中吸收水分，造成皮肤损伤[19]。ASP 和4 种当归多糖片段主要是由甘露糖、葡萄糖、半乳糖等组成，分子中含有大量的—OH，与空气中的水分子形成分子间氢键的能力强，且多糖片段分子内部有细小孔洞，在100 ℃内稳定性良好、水溶液成膜性好，能够有效锁住水分，适合作为保湿剂添加到护肤品中。

3 结论

(1）通过单因素实验和响应面实验对当归多糖的酸剪切工艺条件进行优化，当归多糖剪切片段的总抗氧化活性最高的工艺条件为：剪切试剂HCl 浓度0.15 mol/L、时间1.5 h、温度80 ℃，在此条件下，当归多糖剪切片段的总抗氧化活性为29.87%±0.30%。

(2）当归多糖片段ASP-1a、ASP-2a、ASP-3a、ASP-4a 均具有一定的抗氧化、美白、吸湿、保湿活性。其中，ASP-1a 综合抗氧化、美白、吸湿和保湿功效较优。ASP-1a 由Glc、Man 和Rha 以物质的量之比为550∶3.49∶3.18 组成，是4 种多糖片段中唯一含有Rha 的独特多糖，重均分子量为19014，30 ～200 ℃的质量损失率为 7.87%。对 DPPH•、ABTS+•、•O2-和•OH 的IC50 分别为679.86、381.18、644.87、906.55 μg/mL；对酪氨酸酶单酚酶、二酚酶的IC50 分别为6.78、10.97 μg/mL；在20 ℃、相对湿度43 %的环境中，吸湿率和保湿率分别>107.00%、>99.40%，在20 ℃、相对湿度83%的环境中，吸湿率和保湿率分别>143.00%、>99.80%。

(3）活性多糖ASP-1a 中有可能存在特定的“活性中心”，且重均分子量较小的多糖溶解性好，更易进入生物体内发挥药理作用[3]。

本文经酸剪切和柱层析法纯化的ASP-1a 有望开发为集抗氧化、美白、保湿、吸湿功能于一体的天然绿色美容原料，应用于食品、化妆品和医药领域，可为当归植物资源的二次开发与利用提供参考。

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Purification of Angelica sinensis polysaccharide acid-shear fragments and antioxidant, whitening, moisture-absorptive and moisturizing activities

KANG Shuhe1,2,3,4, LI Qiuping1,2,3,4, LI Shengshuo1,2,3,4, LU Lina1,2,3,4,YUAN Mengyao1,2,3,4, LI Li1,2,3,4, AN Lili1,2,3,4
(1. Key Laboratory of Environment-Friendly Composites of the State Ethnic Affairs Commission, Lanzhou 730106,Gansu, China; 2. Gansu Provincial Biomass Function Composites Engineering Research Center, Lanzhou 730106,Gansu, China; 3. Key Laboratory for Utility of Environment-Friendly Composite Materials and Biomass in University of Gansu Province, Lanzhou 730106, Gansu, China; 4. School of Chemical Engineering, Northwest Minzu University,Lanzhou 730106, Gansu, China）

Abstract: The shearing process of Angelica sinensis polysaccharide (APS) was optimized using single factor and response surface experiments. The mixture of Angelica sinensis polysaccharide molecular fragments after acid shearing was separated and purified by column chromatography to obtain Angelica sinensis polysaccharide fragments. The polysaccharide fragments of Angelica sinensis were characterized using UV-Vis, FTIR, HPGPC, HPLC, SEM, and TGA, and evaluated for their scavenging rate for 1,1-biphenyl-2-picrylhydrazone (DPPH) free radical, 2,2'-hydrazine bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)diamine cation (ABTS+) free radical, superoxide free radical (•O2-) and hydroxyl radicals (•OH), as well as their whitening activity based on the tyrosinase scavenging experiment. The moisture absorptive and moisturizing activities of Angelica sinensis polysaccharide fragments were further investigated under different relative humidity conditions. The results showed that under the optimal process of shearing time 1.5 h, shearing temperature 80 ℃, hydrochloric acid concentration 0.15 mol/L, the total antioxidant activity of shearing Angelica sinensis polysaccharide fragments was 29.87%±0.30%. After purification, Angelica sinensis polysaccharide acid-shearing fragments with four different relative molecular mass (in short molecular mass) (ASP-1a ～ASP-4a) were obtained, with all displaying certain antioxidant, whitening,hygroscopic, and moisturizing activities. Among them, ASP-1a was composed of glucose (Glc), mannose(Man), and rhamnose (Rha) with a molar ratio of 550∶3.49∶3.18, which was the only polysaccharide containing Rha, with a weight-average molecular mass of 19014, and the mass loss rate at 30 ～200 ℃ was 7.87%. The median inhibition mass concentrations (IC50) for DPPH•, ABTS+•, •OH, and O2-• were 679.86,381.18, 644.87, and 906.55 μg/mL, respectively. The IC50 for tyrosinase monophenolase and diphenolase were 6.78 and 10.97 g/L, respectively. In an environment with a relative humidity of 43% at 20 ℃, the moisture absorptive rate and moisturizing rate were >107.00% and >99.40%, respectively, while in an environment with a relative humidity of 83% at 20 ℃, the moisture absorption rate and moisturizing rate were >143.00% and >99.80%, respectively. ASP-1a exhibited the best comprehensive antioxidant,whitening, moisturizing absorption and moisturizing effects.

Key words: Angelica sinensis polysaccharide fragments; acid-shearing; response surface methodology;antioxidation; whitening; moisture absorption; moisturizing; modernization technology of traditional Chinese medicines

中图分类号: R284.2

文献标识码: A

文章编号: 1003-5214 (2025) 12-2703-14

收稿日期: 2024-11-29; 定用日期:2025-01-03;

DOI: 10.13550/j.jxhg.20240898

基金项目: 国家自然科学基金项目(NSFC82460820）；甘肃省教育厅高校教师创新基金项目(2025B-036）；2024 西北民族大学创新团队项目(1001660139、1001660141）

作者简介: 康淑荷(1972—），女，副教授，硕士生导师，E-mail：523429214@qq.com。