氧化应激是指体内氧化反应与抗氧化防御系统之间失衡的状态，表现为自由基产生过多或抗氧化能力下降。据报道，氧化应激会导致动物体内自由基积累，损伤细胞膜，影响蛋白质和DNA 的结构与功能，从而引发一系列健康问题，如免疫抑制、生长迟缓等[1-2]。为了减轻氧化应激对机体的负面影响，采取添加绿色、安全的抗氧化剂是一种有效措施。

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）是一种广泛种植的多年生豆科苜蓿属植物[3]。紫花苜蓿富含黄酮、三萜皂苷类和多糖等生物活性成分，具有抗炎和抗氧化活性等生物特性，可用于调节氧化应激并治疗多种疾病[4-5]；此外，也有文献证实紫花苜蓿提取物可以抑制环磷酰胺诱导的大鼠氧化应激的升高[6]。山楂叶是蔷薇科植物山楂（Crataegus pinnatifida Bge.）的干燥叶，其提取物含有良好抗氧化活性的多酚类化合物，可以成为医药以及食品等领域的合适原料，因此，受到广泛关注[7-8]。SHAHEIN 等[9]向氧化应激状态的大鼠食物中加入山楂叶提取物强化的酸奶，大鼠体内甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白和丙二醛水平显著降低，表明山楂叶提取物可以对大鼠的氧化应激发挥保护作用。另有研究表明，山楂叶中的黄酮类物质可能通过影响肝脏脂质转运而减弱血脂指数和炎症因子[10-11]，还可以通过上调细胞内核因子E2 相关因子2（Nrf2）、NQO-1 和血红素氧合酶1（HO-1）蛋白表达降低氧化应激，可作为阿尔茨海默病治疗剂的潜在候选者[12]。氧化应激会导致体内活性氧（ROS）的产生与清除失衡，造成细胞结构和功能受损，从而引发心血管疾病、糖尿病、神经退行性疾病等多种疾病的发生[13-15]。LIU等[16]研究证明，紫花苜蓿根部多糖能够显著上调经过油酸处理过的Nrf2 和HO-1 蛋白的表达，缓解氧化应激，从而在非酒精性脂肪肝病的治疗中发挥作用。QIAO 等[17]研究发现，山楂叶提取物可以显著缓解鲜切马铃薯的褐变，通过稳定膜和调节ROS 的氧化还原反应，可作为天然的抗褐变替代品。FENG等[18]研究发现，山楂叶提取物（HLE）与质量分数1.5%的壳聚糖溶液（CH）混合制成的涂层溶液可显著延缓草莓果实的腐败，有效减少丙二醛（MDA）水平和超氧阴离子的产生，表明CH-HLE 在保护水果和蔬菜方面具有巨大潜力，为采后保存提供了一种环境可持续的解决方案。本课题组前期研究证实，紫花苜蓿与山楂叶提取物质量比6∶4 的复配物可能通过抗氧化的途径达到降脂的目的[19]，但并未深入研究其具体的抗氧化作用机制。

本文拟深入探讨紫花苜蓿与山楂叶提取物复配物的抗氧化应激活性及其作用机制，以期为其作为天然抗氧化剂的实际应用提供理论依据。

1 实验部分

1.1 材料、试剂与仪器

紫花苜蓿，内蒙古蒙草生态环境（集团）股份有限公司；山楂叶，河北省安国市金草中药饮片有限公司；HepG2 细胞，上海富恒生物科技有限公司；DMEM 培养基、甲醇（分析纯），美国Thermo Fisher Scientific 公司；Reactive Oxygen Species Assay Kit ROS 检测试剂盒，翌圣生物科技（上海）股份有限公司；RIPA 裂解液、PMSF、BCA 蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE 配胶试剂盒、蛋白上样缓冲液（5x）、脱脂奶粉、一抗/二抗稀释液、ECL 化学发光试剂盒，碧云天生物技术有限公司；葡萄糖标准品、苯酚、乙醇（体积分数95%），分析纯，天津市恒兴化学试剂制造有限公司；浓硫酸（质量分数98%），分析纯，天津市富宇精细化工有限公司；铁氰化钾（质量分数1%）、三氯乙酸（质量分数10%）、FeCl3、油酸，分析纯，上海麦克林生化科技股份有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2,2'-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐（ABTS），分析纯，北京生物化学试剂科技有限公司；K2SO8，分析纯，沈阳天罡试剂厂；磷酸盐缓冲液（PBS，pH=6.8）、甘氨酸、Tris、十二烷基硫酸钠、Tween 20，分析纯，北京博奥拓达科技有限公司；兔源Nrf2 抗体，美国Cell Signaling Technology 公司；兔源HO-1抗体，美国Affinity Biosciences 公司；兔源β-actin抗体、山羊抗兔IgG/HRP 二抗，北京博奥森生物技术有限公司。

V-5100 型紫外-可见分光光度计，上海元析仪器有限公司；MF53-M 型荧光显微镜，广州市明美光电技术有限公司；Mini-PROTEAN® Tetra 电泳槽、Mini Trans-Blot® 转印槽、ChemiDoc MP 全能型成像系统，伯乐生命医学产品（上海）有限公司。

1.2 方法

采用热水提取法制备紫花苜蓿提取物（ME）[20]。将干燥的紫花苜蓿剪成小段，按照料液比（g∶mL，下同）1∶10 加入蒸馏水进行提取，提取温度100 ℃，每次提取时间2 h，提取次数3 次。提取液经过纱布（60 目）过滤后，减压浓缩得到浸膏。浸膏置于55 ℃恒温干燥箱内干燥至恒重，得到易溶于水的深棕色无味浸膏状紫花苜蓿提取物，记为 ME，于–20 ℃保存备用。

采用ME 的制备方法和步骤，以山楂叶为原料，制得山楂叶提取物，山楂叶提取物为易溶于水的棕色膏状物，记为HE，于–20 ℃保存备用。

根据课题组前期的初步筛选结果[19]。将恒重状态的ME 和HE 浸膏以质量比6∶4 进行复配，复配物记为ME+HE，对ME+HE 进行抗氧化性等方面的考察。

1.3 结构表征与性能测试

1.3.1 总黄酮含量的测定

采用亚硝酸钠-三氯化铝法[21]测定ME 的总黄酮含量，以芦丁作为标准对照品。

待测液配制：取1000 mg（m0）ME（或HE、ME+HE，下同），加30 mL 甲醇，超声30 min 溶解，离心后取上清，移入50 mL（V1）容量瓶，甲醇定容；将21 mL（V2）定容后的溶液加入100 mL（V3）容量瓶，蒸馏水定容，即得ME 待测液。

芦丁标准曲线的绘制：配制质量浓度为0.2 g/L的芦丁甲醇溶液；分别取0、1、2、3、4、5、6 mL芦丁甲醇溶液至7 个25 mL 容量瓶，加水至约6 mL，再各加1 mL 质量分数为5%的NaNO2 溶液和1 mL质量分数为10%的Al(NO3)3 溶液；静置6 min 后，加入10 mL 质量分数为5%的NaOH 溶液，去离子水定容，室温（25 ℃）静置15 min。使用紫外-可见分光光度计测定各溶液在510 nm 处的吸光度，绘制芦丁吸光度（y）-质量浓度（x，g/L）标准曲线，并得到拟合标准回归方程 y=11.397x+0.0015，R2=0.9995。

样品测定：取4 mL（V4）ME（或HE、ME+HE，下同）待测液，加水补足至6 mL；之后，按照芦丁标准溶液的制备步骤进行处理，制备ME 二次待测液（V5，25 mL）；按照芦丁吸光度（y）-质量浓度（x）标准回归方程计算ME 二次待测液中总黄酮的质量浓度（ρ，g/L）；最后，根据式（1）计算ME中总黄酮的质量分数〔w(ME)，%〕：

采用ME 中总黄酮质量分数的测定方法和步骤，测定HE 中总黄酮的质量分数〔w(HE)，%〕、ME+HE 中总黄酮的质量分数〔w(ME+HE)，%〕。

1.3.2 总三萜皂苷含量的测定

采用香草醛-高氯酸法[22]测定ME 的总三萜皂苷含量，以齐墩果酸作为标准对照品。

待测液配制：按照1.3.1 节方法和步骤配制ME待测液。

齐墩果酸标准曲线的绘制：配制质量浓度为0.2 g/L 的齐墩果酸甲醇溶液；分别取0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL 芦丁甲醇溶液至7 个25 mL比色管，挥发溶剂后加0.2 mL 质量分数为5%的香草醛冰醋酸溶液和0.8 mL 高氯酸，于80 ℃水浴20 min，冰水浴冷却20 min；随后，加入5 mL 冰醋酸，使用紫外-可见分光光度计测定各溶液在550 nm 处吸光度，绘制齐墩果酸吸光度（y）-质量浓度（x，g/L）标准曲线，并拟合标准回归方程y=69.51x-0.0207，R2=0.9971。

样品测定：精密量取0.5 mL（V4）ME 待测液，按照齐墩果酸标准溶液的制备步骤进行处理，制备ME 二次待测液（V5，25 mL）。按照齐墩果酸吸光度（y）-质量浓度（x）标准回归方程计算ME 二次待测液中总三萜皂苷的质量浓度（ρ，g/L）；最后，根据式（1）计算 ME 中总三萜皂苷的质量分数〔w(ME)总三萜皂苷，%〕。

采用ME 中总三萜皂苷质量分数的测定方法和步骤，测定HE 中总三萜皂苷的质量分数〔w(HE)总三萜皂苷，%〕、ME+HE 中总三萜皂苷的质量分数〔w(ME+HE)总三萜皂苷，%〕。

1.3.3 总多糖含量的测定

采用苯酚硫酸法[23]测定ME 的总多糖含量，以葡萄糖作为标准对照品。

待测液配制：将恒重的ME 浸膏加蒸馏水溶解，配制成质量浓度0.03 g/L 的ME 待测液。

葡萄糖标准曲线的绘制：首先，将质量浓度为0.1 g/L 的葡萄糖标准品母液稀释配制成质量浓度为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 g/L 的一系列标准品溶液；试管中分别加入300 μL 各质量浓度标准品溶液和700 μL 蒸馏水，再依次加入0.5 mL 质量分数6%的苯酚溶液和2.5 mL 浓硫酸，振荡混匀，反应30 min；使用紫外-可见分光光度计测定各溶液在490 nm 处的吸光度，绘制葡萄糖吸光度（y）-质量浓度（x，g/L）标准曲线，并拟合标准回归方程y=12.1x+0.2427，R2=0.9902。

样品测定：试管中分别加入300 μL 质量浓度为0.03 g/L 的ME 待测液和700 μL 蒸馏水；再依次加入0.5 mL 质量分数为6%的苯酚溶液和2.5 mL 浓硫酸，振荡混匀，反应30 min；使用紫外-可见分光光度计测定各溶液在490 nm 处的吸光度；最后，根据葡萄糖标准曲线回归方程y=12.1x+0.2427，R2=0.9902，计算ME 中总多糖的质量分数〔w(ME)总多糖，%〕。

采用ME 中总多糖的质量分数的测定方法和步骤，测定HE 中总多糖的质量分数〔w(HE)总多糖，%〕、MER+HE 中总多糖的质量分数〔w(ME+HE)总多糖，%〕。

1.4 抗氧化应激活性实验

1.4.1 自由基清除能力的测定

样品液的配制：用体积分数为50%的乙醇将ME配制成质量浓度为10 g/L 的样品储备液，将其再用体积分数为50%的乙醇分别稀释，得到质量浓度为0.005、0.02、0.08、0.3、0.8、2、5 g/L 的ME 样品液。HE、ME+HE 样品液的配制方法和ME 样品液相同。

阳性对照为抗坏血酸（VC），其质量浓度（0.005、0.02、0.08、0.3、0.8、2、5 g/L）与ME、HE、ME+HE样品液相同。

ABTS 工作液配制：将浓度7 mmol/L 的ABTS储备液和浓度2.45 mmol/L 的K2SO8 溶液等体积混合，室温下，避光反应12~16 h；反应结束后，用无水乙醇稀释，使稀释后的工作液在734 nm 波长处的吸光度在0.70±0.02 的范围内，即得ABTS 工作液，避光备用。

DPPH 工作液配制：将适量的DPPH 粉末加入到无水乙醇中充分溶解，配制成浓度为2 mmol/L的DPPH 储备液；使用前，将DPPH 储备液用无水乙醇稀释为0.2 mmol/L 的DPPH 工作液，避光备用。

自由基清除实验：实验分为3 组，分别为空白对照组（B0）、样品组（B1）、样品本底组（B2），以VC 为阳性对照组，各组溶液配制如表1~3 所示。ABTS阳离子（ABTS+）自由基清除实验，避光反应10 min，在734 nm 处测定吸光度[24]；DPPH 自由基清除实验，避光反应30 min，在517 nm 处测定其吸光度[25]；羟基自由基清除实验，避光反应10 min，在510 nm处测定其吸光度[26]。根据式（2）计算各自由基清除率（R，%）：

式中：A0、A1、A2 分别为B0、B1、B2 组的吸光度。

1.4.2 总还原能力的测定

参照王鑫等[27]的实验方法并稍作修改。按照1.4.1 节方法和步骤配制ME、HE、ME+HE 样品液。取2 mL 样品液，分别加入2 mL 质量分数为1%的铁氰化钾溶液和2 mL 浓度为0.1 mol/L 的PBS（pH=6.8），混匀，在50 ℃水浴中反应20 min，冷却至室温后，迅速加入2.5 mL 质量分数为10%的三氯乙酸溶液，3000 r/min 离心10 min。取上清液2 mL，依次加入2.5 mL 蒸馏水和0.5 mL 质量分数为0.1%的FeCl3 溶液，混匀，避光静置10 min，在700 nm 处测定其吸光度。相同质量浓度的VC 为阳性对照，以测得的吸光度来评价样品的还原能力。

1.5 细胞内ROS 清除能力实验

基于本课题组[19]前期的MTT 实验结果，参照文献[28] 方法，进行样品的细胞内ROS 清除能力评价。

HepG2 细胞以1.5×105 个/孔接种于12 孔板中，培养24 h 后加药，实验设置11 组：对照组（Control）、经油酸处理的模型组（OA），ME+HE 低、中、高剂量组（LC、MC、HC），ME 低、中、高剂量组（LME、MME、HME），HE 低、中、高剂量组（LHE、MHE、HHE）。其中，ME+HE 质量浓度分别为0.9375、1.8750、3.7500 g/L。ME 和HE 的低、中、高质量浓度与ME+HE 组相同。各组药物质量浓度均按照实验设计准确配制，确保实验条件一致。加药培养24 h，然后使用ROS 试剂盒检测，在荧光显微镜下检测荧光强度，评估细胞内ROS 清除能力。

1.6 细胞内氧化应激相关蛋白表达测试

HepG2 细胞以1.5×105 个/孔接种于12 孔板中，培养24 h 后加药，实验设置5 组：对照组（Control）、经油酸处理的模型组（OA）、ME+HE 低、中、高剂量组（LC、MC、HC，质量浓度分别为0.9375、1.875、3.750 g/L）。孵育24 h，测蛋白含量，计算上样体积，蛋白与缓冲液以体积比 4∶1 混合，100 ℃加热5 min 使蛋白变性，冷却后4 ℃储存备用。

取30 μg 变性蛋白进行电泳、电转，用脱脂牛奶封闭2 h，分别用Nrf2、HO-1 抗体以及β-actin 抗体4 ℃孵育过夜。PBS 清洗4 次，每次8 min，室温孵育二抗2 h，同样方法清洗，化学发光法显色。使用凝胶成像仪对蛋白条带进行拍照，Image J 软件分析计算蛋白相对表达水平。

1.7 数据处理

数据采用GraphPad Prism 10 进行处理，所有结果均以“算数平均值±标准差”的方式进行表示，使用单因素方差分析进行多组数据间的统计分析，P<0.05 具有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 总黄酮、总皂苷、总多糖含量的分析

表4 为ME、HE 和ME+HE 的总黄酮、总三萜皂苷、总多糖质量分数。

从表4 可以看出，ME、HE 和ME+HE 中总黄酮质量分数分别为3.60%±0.10%、14.12%±2.73%和7.13%±1.55%；总三萜皂苷质量分数分别为1.90%±0.15%、4.08%±1.17%和2.85%±0.50%；总多糖质量分数分别为 12.38%±4.75% 、 26.27%±0.73% 和18.37%±1.83%。总黄酮、总三萜皂苷、总多糖质量分数的大小排序为：HE>ME+HE>ME。

2.2 抗氧化应激活性分析

2.2.1 ABTS+自由基清除能力

图1 为ME、HE 和ME+HE 的ABTS+自由基清除率测试结果。

从图1 可以看出，ME、HE 和ME+HE 均展现良好的ABTS+自由基清除能力。质量浓度为5 g/L的ME+HE 和HE 的ABTS+自由基清除效果相近且优于ME，HE、ME+HE、ME 对ABTS+自由基清除率分别为97.15%、95.75%和89.56%，接近VC 的98.18%。

2.2.2 DPPH 自由基清除能力

图2 为ME、HE 和ME+HE 的DPPH 自由基清除率测试结果。

从图2 可以看出，ME、HE 和ME+HE 均展现剂量依赖性的DPPH 自由基清除能力。质量浓度为5 g/L 的ME+HE、HE 和ME 的DPPH 自由基清除率分别为92.74%、89.68%和77.67%，ME+HE 的DPPH自由基清除率接近VC 的98.49%，表明合理的配比可增强HE 和ME 的DPPH 自由基清除能力。

2.2.3 羟基自由基清除能力

图3 为ME、HE 和ME+HE 的羟基自由基清除率测试结果。

从图3 可以看出，ME、HE 和ME+HE 均展现剂量依赖性的羟基自由基清除能力。质量浓度为5 g/L 的ME+HE、HE 和ME 的羟基自由基清除率分别为76.00%、69.96%和48.72%，明显低于VC的98.87%。

2.2.4 总还原力

图4 为ME、HE 和ME+HE 的总还原能力测试结果。

从图4 可以看出，ME、HE 和ME+HE 在700 nm处的吸光度随着质量浓度的增加而增强，且呈剂量依赖性。VC 的吸光度最大，质量浓度为5 g/L 的ME+HE 的吸光度（2.415）高于HE（2.082），更明显高于ME（1.376），表明ME+HE 总还原能力显著高于ME 和HE，但低于VC。

结果显示，ME、HE 和ME+HE 均显示出对ABTS+自由基、DPPH 自由基和羟基自由基良好的清除能力以及总还原能力。其中，HE 的抗氧化活性优于ME，这可能与其较高的黄酮、皂苷和多糖等活性成分含量有关（表4）。

已有大量研究表明，天然植物的抗氧化能力与其黄酮含量密切相关[29]，同时，植物中的其他活性成分，如皂苷和多糖也具有较强的自由基清除能力[30-31]。ME+HE 对ABTS+自由基、DPPH 自由基和羟基自由基的清除能力和总还原能力显著提升，分别比ME 提高了6.91%、19.40%、55.99%和75.51%。表明，与HE 复配可以有效增强ME 的抗氧化能力。尽管ME+HE 总黄酮、总三萜皂苷、总多糖的含量低于HE，但ME+HE 的抗氧化活性却优于HE 单独使用，这可能与各成分间的协同效应有关。有研究表明，植物提取物中的多种成分（如黄酮类、皂苷类等），在保证总黄酮以及总皂苷达到一定含量的情况下，即可以通过协同作用增强生物活性[32-34]，如果总黄酮、总皂苷含量过高，可能有一定负面作用。从本文实验结果来看，ME的三者含量可能未足够，HE 的相关指标含量可能过高，而复配后不同成分之间的相互作用能提升整体抗氧化效果。具体的原因还需在今后的实验中继续探究。

2.3 细胞内ROS 清除能力分析

ROS 是在有氧代谢过程中产生的一类含氧化学反应物质[35]。当ROS 产生过多或抗氧化系统功能减弱时，ROS 会导致细胞膜脂质过氧化、蛋白质变性和DNA 损伤，从而引起细胞功能和结构的损害，甚至导致细胞死亡[36-37]。图5 为各实验组的细胞内ROS 水平测定结果。

从图5 的HepG2 细胞内ROS 的产生水平结果可以看出，对照组（Control）正常的HepG2 细胞荧光较弱，经过油酸处理的模型组（OA）细胞荧光强度明显增强，表明高脂细胞内产生过量的ROS。在高脂细胞内加入与ME+HE 各质量浓度相同的ME，细胞的荧光强度随着ME 质量浓度的增加而降低，表明ME 能够有效抑制细胞内ROS 的生成，且其抑制效果呈剂量依赖性。当高脂细胞内加入与ME+HE相同质量浓度的HE 时，细胞内荧光强度随HE 质量浓度的增加而降低。表明HE 同样能够显著抑制细胞内ROS 的生成，且其抑制效果也呈剂量依赖性。在经油酸诱导的高脂细胞内加入不同质量浓度的ME+HE 后，细胞内荧光强度显著减弱，表明ME+HE能够显著抑制细胞内ROS 的生成，且其抑制效果同样呈剂量依赖性。

定量分析结果如图6 所示，进一步证实了复配物ME+HE 对细胞内ROS 生成的抑制作用。ME+HE低、中剂量使用时，其对细胞内ROS 的清除效果优于同质量浓度单独使用ME 和HE 的清除效果；当高剂量使用时，复配物ME+HE 的清除能力较单独使用ME 时提高了67.6%。此外，高剂量单独使用HE 时的清除效果接近复配物ME+HE，这可能是由于，实验中选取的HHE 质量浓度高于对HepG2 细胞的安全质量浓度范围（0~3 g/L）。因此，在实际应用中，应参考药物对细胞的安全质量浓度，合理选择适宜质量浓度，以确保实验结果的可靠性和安全性。综上，ME 和HE 经过复配后能加有效抑制细胞内ROS 的生成，从而发挥抗氧化应激的作用。

2.4 细胞内氧化应激相关蛋白表达测试结果

相关研究发现，Nrf2 和HO-1 通路可以通过抗炎、抗氧化等作用抵抗氧化应激损伤[38]。

因此，有效调控Nrf2 或HO-1 通路可能成为治疗氧化应激性疾病和炎性疾病的重要靶点。图7 和8 分别为不同质量浓度ME+HE 处理后HepG2 细胞中Nrf2 和HO-1 蛋白表达结果。

可以看出，油酸处理的HepG2 细胞中Nrf2（图7）和HO-1（图8）蛋白表达均下降，表明油酸阻断了细胞内 Nrf2 激活并抑制了 HO-1 表达。而ME+HE 处理能剂量依赖性地提升这两种蛋白的表达。相较OA 组，LC 组、MC 组和HC 组的Nrf2 蛋白表达分别增加了10.5%、48.9%和53.3%，HO-1蛋白表达分别增加了72.0%、82.0%、85.3%。表明ME+HE 可以通过Nrf2/HO-1 通路发挥抗氧化应激的作用，这可能与其所含黄酮、皂苷类化合物以及多糖等活性成分有关。

3 结论

（1）ME、HE 和ME+HE 的总黄酮质量分数分别为3.60%±0.10%、14.12%±2.73%、7.13%±1.55%，总三萜皂苷质量分数分别为1.90%±0.15%、4.08%±1.17%、2.85%±0.50%，总多糖质量分数分别为12.38%±4.75%、26.27%±0.73%、18.37%±1.83%。

（2）与ME 相比，ME+HE 可以显著增强对ABTS+自由基、DPPH 自由基、羟基自由基的清除能力以及总还原能力，质量浓度为5 g/L 的ME+HE对ABTS+自由基、DPPH 自由基清除率（95.75%、92.74%）接近阳性对照组（VC）水平（98.18%、98.49%）。

（3）ME+HE 可以显著抑制ROS 的生成，而且其对ROS 的清除能力优于单独使用ME 和HE。

（4）ME+HE 以剂量依赖性上调Nrf2 和HO-1蛋白的表达，证实其具有正向调节氧化应激的潜力。

ME+HE 具有较强的抗氧化活性，可以通过上调Nrf2 和HO-1 蛋白的表达调控氧化应激状态，推测上述性能和其含有丰富的黄酮、三萜皂苷类、多糖等活性成分有关。可以为紫花苜蓿和山楂叶资源作为天然抗氧化剂等精细化工添加剂的应用提供理论基础。

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Antioxidative stress activity and action mechanism of complex from alfalfa extract and hawthorn leaf extract

YANG Yang1, WANG Yaoyao1, LI Danqi2,3, GAO Pinyi1,2, LIU Xuegui2,3,4*
（1. College of Chemical Engineering, Shenyang University of Chemical Technology, Shenyang 110142, Liaoning,China; 2. Institute of Functional Molecules, Shenyang University of Chemical Technology, Shenyang 110142, Liaoning,China; 3. Liaoning Province Key Laboratory of Green Functional Molecular Design and Development, Shenyang University of Chemical Technology, Shenyang 110142, Liaoning, China; 4. National-Local Joint Engineering Laboratory for Development of Boron and Magnesium Resources and Fine Chemical Technology, Shenyang University of Chemical Technology, Shenyang 110142, Liaoning, China）

Abstract：In order to explore the anti-oxidative stress activity and action mechanism of the complex of alfalfa extract (ME) and hawthorn leaf extract (HE), the mass fractions of total flavonoids, total triterpenoid saponins and total polysaccharides in ME, HE and their complex (ME+HE) with a mass ratio of ME to HE of 6∶4 were determined by ultraviolet spectrophotometry. The in vitro antioxidant activities of ME, HE and ME+HE were evaluated by free radical scavenging experiments, total reduction ability determination and intracellular reactive oxygen species (ROS) scavenging experiment. The anti-oxidative stress mechanism of ME+HE was investigated by Western Blot. The results showed that the mass fractions of total flavonoids in ME, HE and ME+HE were 3.60%±0.10%, 14.12%±2.73% and 7.13%±1.55%,respectively, those of total triterpenoid saponins in ME, HE and ME+HE were 1.90%±0.15%,4.08%±1.17% and 2.85%±0.50%, respectively, and those of total polysaccharides in ME, HE and ME+HE were 12.38%±4.75%, 26.27%±0.73% and 18.37%±1.83%, respectively. ME+HE with a mass concentration of 5 g/L exhibited good diammonium2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate) cation (ATBS+)radical, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical, and hydroxyl radical scavenging ability, with the corresponding scavenging rates of 95.75%, 92.74%, and 76.00%, respectively. The total reduction ability was 75.51% higher than that of ME. ME+HE could significantly remove excessive ROS in cells, and the inhibitory ability was better than that of ME and HE alone. The expression of nuclear factor E2-related factor 2 (Nrf2) and heme oxygenase 1 (HO-1) protein in HepG2 cells was down-regulated after oleic acid induction. After treatment with different doses (0.9375, 1.8750, 3.7500 g/L) of ME+HE, the expression levels of Nrf2 and HO-1 proteins were up-regulated. The expression of Nrf2 protein increased by 10.5%,48.9% and 53.3%, respectively, and that of HO-1 protein increased by 72.0%, 82.0% and 85.3%,respectively, showing a dose-dependence. ME+HE could improve antioxidant capacity through Nrf2/HO-1 signaling and play an anti-oxidative stress role.

Key words：alfalfa; hawthorn leaf; extract; compound; antioxidative stress; food chemicals

中图分类号：TQ28

文献标识码：A

文章编号：1003-5214 (2026) 02-0430-09

收稿日期：2024-12-26; 定用日期：2025-02-10; DOI：10.13550/j.jxhg.20240942

基金项目：辽宁省科技厅项目（2023JH2/101600021）；辽宁省教育厅高等学校基础研究项目（LJ212410149033）

作者简介：杨 洋（1998—），女，硕士生，E-mail：1280236100@qq.com。联系人：刘学贵 （1972—），男，教授，E-mail：liuxuegui@syuct.edu.cn。