多糖是由10个以上的单糖通过糖苷键形成的高分子碳水化合物，广泛分布于植物、动物、真菌和细菌等生物体内[1-3]。植物多糖具有来源丰富、毒性低、可控性强等优点，在开发和利用方面具有很大潜力[4]。目前，越来越多的科学家将多糖视为生命过程中不可或缺的信息和功能分子，这些分子发挥着支持细胞生长、分化和发育的重要作用[5]。尽管自然界中有32种单糖，但人体内的糖链仅由9种单糖构成[2]。由于人体内的糖链与自然界中存在的糖链在结构上具有某种程度的相似性，外源性糖化合物的施用，理论上会干扰体内细胞合成糖链的功能，从而达到预防和治疗疾病的效果[6]。

鬼臼（Podophyllum emodi）属于龙胆科，起源于亚洲，以其独特的伞状叶片排列而被称为“八角莲”[7]。现代药理研究表明，鬼臼中多糖具有重要的生物活性，如抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、抗辐射、降血糖、降血脂、增强免疫力及保护肝肾等[8-9]。多项研究表明，不同工艺提取的多糖结构、理化性质及生物活性也大不相同。

目前，多糖的提取方法主要包括热水浸提法[10]、酸性水解法[11]、超声辅助法[12]、超声微波联用法[13]、酶辅助法[14]等。其中，热水浸提简单便捷，但提取时间较长且提取率较低；酸性水解法虽然提高了多糖的提取率，但对体系pH要求较为苛刻，且反应不易控制；酶辅助提取法借助底物与酶的特异性结合，在最优条件下进行水解，具有时间短、条件温和等优点，但成本较高；超声辅助提取利用超声波的机械作用和空化效应，破坏细胞壁和细胞膜，有效提高多糖的释放效率，表现出高提取率、短时间和低能耗的优势。离子液体是一种新型萃取溶剂，具备优越的稳定性、高萃取率及设计性强等特点，能够有效提取植物中的多种活性成分，进而获得更高纯度的活性物质。为了在短时间内获得更高的提取率，超声辅助离子液体法提取植物多糖逐渐被广泛应用。JIANG等[15]采用超声辅助离子液体法提取准噶尔山楂多糖，表明离子液体可溶性山楂果实多糖对体外抗氧化能力优于热水提取的多糖。李文文等[16]比较了酶解超声辅助和超声辅助离子液体提取藁本多糖的最优工艺条件，发现超声辅助离子液体多糖得率较高，提取物降糖活性较好。

本文拟采用超声辅助离子液体提取鬼臼多糖（PEP），对提取的粗多糖进行分离、纯化及理化性质分析与结构表征，并评估其抗氧化和降糖活性。以期为鬼臼资源的深度开发及其药用价值提供理论基础，也为其他药用植物多糖的提取提供思路。

1 实验部分

1.1 材料、试剂与仪器

鬼臼，新鲜采摘于云南省沧源县芒卡镇，经伊犁师范大学天然产物研究与开发重点实验室南光明教授鉴定为龙胆科鬼臼属植物鬼臼的果实；透析袋（截留相对分子质量为3500 Da），美国BioSharp公司；DEAE-650 M型纤维素柱（37 cm×260 mm）、Sephadex G-750型凝胶柱（16 mm×800 mm），英国Whatman公司。

无水乙醇、石油醚、苯酚溶液（质量分数6%）、H2O2（质量分数30%）、浓硫酸（质量分数98%）、氯化钠、氢氧化钠、正丁醇、三氯甲烷、三氯乙酸、甲醇、吡啶、二氯甲烷，分析纯，天津市大茂化学试剂厂；蓝色葡聚糖、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2,2'-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐（ABTS）、抗坏血酸（VC），上海麦克林生化科技股份有限公司；2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）、四丁基铵（TYHS）、四乙基铵（TYLM）、1-丁基-3-甲基咪唑氯盐（BMIMCl）、1-乙基-3甲基咪唑溴盐（EMDC）、乙二胺四乙酸（EDTA）、1-烷基-3-甲基咪唑溴盐（EADS）、1-乙基-3-甲基咪唑（EMIMBr）、四乙基氯化铵溴盐（TEAC）、四丁基氯化铵（TBACl）、1-烷基-3-甲基咪唑四硼酸盐（MSDS）、磷酸烯醇丙酮酸、三氟乙酸（TFA），分析纯，伊犁万隆有限责任公司。实验用水均为去离子水，自制。

XH-2020 D型电脑智能温控低温超声波合成萃取仪，北京翔鹄科技有限公司；CheetahⅡ型多糖分离纯化系统，天津博纳艾杰尔科技有限公司；UV-2550型紫外-可见分光光度计（UV-Vis），日本Shimadzu公司；7500 F型扫描电子显微镜（SEM），日本JOEL；D8 Advandace型X射线衍射仪（XRD）、AVANCE Ⅲ HD核磁共振波谱仪（NMR），德国Bruker公司；Cary 630型傅里叶变换红外光谱仪（FTIR）、6300型气相色谱仪（GC）、PL-GPC50型高效凝胶渗透色谱仪（HAGPC），美国Agilent公司；HS-TGA-102型热重分析仪（TGA），上海和晟仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 鬼臼预处理

将鬼臼自然风干至恒重，粉碎过40目筛，经测定，含水量（质量分数）为0.72%。依次用石油醚、无水乙醇〔液料比（g/L）均为2∶1〕于索氏提取器各脱脂、脱色素24 h后，过滤并收集滤渣，经自然晾干后，记为预处理鬼臼，于-4 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 离子液体配制

分别称取一定量EDTA、BMIMCl、TBACl、EMIMBr、TEAC加入到去离子水中配成离子液体质量分数1.0%（以去离子水加入量计）的水溶液，以未加离子液体为空白对照，考察不同离子液体对鬼臼多糖提取率的影响。

1.2.3 粗鬼臼多糖提取

首先，将5 g鬼臼粉末加入超声波合成萃取仪中，按照液料比（mL∶g，下同）40∶1加入去离子水，在超声温度53.0 ℃，超声时间91.0 min，离子液体BMIMCl质量分数1.0%（以去离子水加入量计，下同）的条件下进行提取。随后，将滤液沉浸过夜后除去下层滤渣，得到鬼臼粗多糖溶液。采用三氯乙酸法[12]除蛋白质，重复多次，直至UV-Vis 谱图于280 nm处无明显吸收峰，经离心（4000 r/min）处理8 min，再减压浓缩至原体积的1/3，加入3倍体积的无水乙醇，醇沉24 h，沉淀物装入透析袋在去离子水中透析（3500 Da，72 h），经冷冻干燥（-70 ℃，48 h）得到淡紫色絮状粗PEP。

1.2.4 鬼臼多糖的分离纯化

精确配制质量浓度为10 g/L的PEP水溶液，随后上样至DEAE-650 M型纤维素柱，采用超纯水和不同浓度的NaCl水溶液（0.2、0.4、0.6 mol/L）进行洗脱，流速为1 mL/min。采用自动收集器收集洗脱液，每管10 mL，收集并合并同一组分，透析48 h后，经冷冻干燥（-70 ℃、24 h），分别得到水洗组分、0.4 mol/L NaCl溶液盐洗组分的鬼臼多糖。

随后，通过Sephadex G-750型凝胶柱进一步纯化，以3倍柱体积的去离子水为洗脱剂，流速0.4 mL/min，自动收集器收集洗脱液，每管10 mL，收集并合并同一组分的多糖溶液。经减压浓缩、透析（3500 Da，72 h）、冷冻干燥（-70 ℃、24 h）得到两种均一组分的多糖，分别记为PEP-I、PEP-Ⅱ。

1.3 结构表征与性能测试

1.3.1 鬼臼多糖提取率计算

采用苯酚硫酸法[17]测定并计算鬼臼多糖提取率。首先，将10 mL不同质量浓度（0～0.8 g/L）的葡萄糖标准液加入容量瓶中，随后分别加入1 mL质量分数为6%的苯酚溶液和5 mL浓硫酸，混合均匀后静置15 min。沸水浴中反应20 min，冷却至室温，用去离子水定容至25 mL。用UV-Vis测定各溶液在490 nm处的吸光度，绘制吸光度（y）-葡萄糖质量浓度（x，g/L）标准曲线，得到拟合回归方程为y=0.4725x＋0.1752（R2=0.9957）。按照上述步骤处理待测样品，将待测样品溶液的吸光度带入标准方程计算得到鬼臼多糖的质量浓度。根据式（1）计算鬼臼多糖提取率（%）。

式中：ρ为鬼臼多糖质量浓度，g/L；N为稀释倍数；V为待测液体积，L；m为样品质量，g。

1.3.2 含水量测定

准确称取5 mg粗PEP，加入1 mL无水甲醇，采用卡尔费休试剂进行滴定，直至卡尔费休水分测定仪检测到终点并自动记录试剂消耗量。根据式（2）计算含水量：

式中：V为滴定消耗卡尔费休试剂的体积，L；T为卡尔费休试剂滴定度，g/L；W为粗PEP质量，g。

1.3.3 蛋白质含量、糖醛酸含量、相对分子质量测定

蛋白质含量采用考马斯亮蓝法测定[18]。糖醛酸含量采用硫酸咔唑法测定[19]。相对分子质量采用高效凝胶渗透色谱仪测定[20]。

1.3.4 单糖组成测定

分别取5 mg的PEP-Ⅰ、PEP-Ⅱ于10 mL顶口瓶中，加入4 mL浓度2 mol/L的TFA，于110 ℃水解4 h。冷却至室温，加入4 mL甲醇，混匀并减压浓缩去除TFA（重复5～6次）。随后，加入8 mg盐酸羟胺和0.5 mL吡啶，于90 ℃反应40 min。反应结束后，冷却至室温，再加入0.5 mL乙酸酐，于90 ℃反应1 h。冷却至室温后，加入1 mL二氯甲烷和1 mL去离子水进行萃取，弃去水相，加水离心（4000 r/min）5 min（重复5～6次），过滤二氯甲烷相并收集于气相小瓶，进行GC分析。单糖标准品不需酸解，其他步骤与上述步骤相同。GC色谱分析条件：色谱柱Vondacap df（30 m×0.25 mm×0.25 µm），程序升温，150 ℃保持2 min，以5 ℃/min升至250 ℃，并保持5 min。载气为氦气，流速1 mL/min，压力8.7 kPa，进样量2 µL，分流比为40∶1。

1.3.5 UV-Vis测试

精确配制质量浓度为1.0 g/L的PEP-Ⅰ、PEP-Ⅱ水溶液。扫描波长范围200～400 nm。

1.3.6 XRD测试

靶材Cu，管电压40 kV，管电流40 mA，Kα射线λ=0.1541 nm，步长0.02°，扫描速率10 (°)/min，扫描范围5°～80°[21]。

1.3.7 SEM测试

样品喷金，低位二次电子（LEI）模式，工作电流20 μA，电子加速电压10.0 kV。

1.3.8 TGA测试

分别称取5 mg的PEP-Ⅰ、PEP-Ⅱ置于铂坩埚中，N2氛围，升温速率10 ℃/min，升温范围25～600 ℃。

1.3.9 FTIR测试

采用KBr压片法，波数范围4000～500 cm-1，分辨率4 cm-1，扫描次数32次。

1.3.10 NMR测试

分别称取30 mg的PEP-Ⅰ、PEP-Ⅱ溶于0.5 mL的D2O中，超声溶解后转移至核磁共振管，NMR室温下测定PEP-Ⅰ、PEP-Ⅱ的1HNMR、13CNMR谱图。

1.3.11 三螺旋结构测试

采用刚果红法[22]分析PEP-Ⅰ、PEP-Ⅱ三螺旋结构。分别移取1 mL质量浓度4 g/L的PEP-Ⅰ、PEP-Ⅱ水溶液，依次加入1 mL浓度0.2 mmol/L的刚果红溶液、3 mL不同浓度的NaOH水溶液（0～ 0.5 mol/L）。混匀后避光反应25 min，用UV-Vis测定溶液在400～600 nm范围内的谱图，并记录最大吸收波长（λmax）。

1.4 单因素实验

按照1.2.3节的提取方法和步骤，分别考察液料比（30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1），超声温度（30、40、50、60、70 ℃），超声时间（30、60、90、120、150 min）和离子液体质量分数（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）对鬼臼多糖提取率的影响。改变单一条件时，其他条件按照1.2.3节进行，待第1个因素条件优化结束后，选择最佳条件开展第2个因素实验，依次直至单因素实验结束，每个实验重复3次。

1.5 响应面实验

根据单因素实验结果，以液料比（A）、超声温度（B）、超声时间（C）和离子液体质量分数（D）为自变量，以鬼臼多糖提取率为评价指标，对4个因素分别设置3个水平，用“-1、0、+1”表示，液料比、超声温度、超声时间和离子液体质量分数根据单因素实验结果中心点取值（表1）。

1.6 体外抗氧化、降糖能力测定

分别配制质量浓度为0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00 g/L的PEP-Ⅰ、PEP-Ⅱ水溶液，以VC、阿卡波糖为阳性对照，参照文献[23]方法，分别测定PEP-Ⅰ、PEP-Ⅱ对DPPH自由基、ABTS+自由基、羟基自由基的清除能力和铁离子还原能力，以及对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性抑制能力，分别计算其最大半抑制质量浓度（IC50）。

2 结果与讨论

2.1 离子液体类型对粗鬼臼多糖提取率的影响

图1为不同离子液体对粗鬼臼多糖提取率（简称鬼臼多糖提取率）的影响。

从图1可以看出，不同离子液体对鬼臼多糖提取率的高低排序为：BMIMCl（36.94%±1.17%）＞EMIMBr（30.33%±1.21%）＞EDTA（24.31%±1.11%）＞TBACl（19.62%±1.13%）＞TEAC（14.25%±1.12%），均高于对照组（空白，12.28%±0.26%）。这可能是因为，BMIMCl是一种二烷基咪唑类离子液体，其咪唑环上2位氢的酸度系数较高（pKa=18.6），相较于其他离子液体更易被电离，导致体系酸度增强，从而促进氢键形成[24]，提高了鬼臼多糖的提取率。因此，采用BMIMCl为离子液体进行后续优化实验。

2.2 单因素实验结果

图2为液料比（a）、超声温度（b）、超声时间（c）和离子液体质量分数（d）对鬼臼多糖提取率的影响。

从图2a可以看出，随着液料比（30∶1～70∶1）的增加，鬼臼多糖提取率呈现先增加后减小的变化趋势。当液料比为40∶1时，鬼臼多糖提取率达到最大，为37.50%±0.32%。这可能是因为，液料比增大会扩大鬼臼粉末与离子液体的接触面积，使鬼臼多糖更容易被提取，但液料比过大时，溶液中杂质溶出增加，从而不利于鬼臼多糖溶出。

从图2b可以看出，随着超声温度（30～70 ℃）的增加，鬼臼多糖提取率呈现先增加后减小的变化趋势。当超声温度为50 ℃时，鬼臼多糖提取率达到最大，为34.92%±0.17%。这可能是因为，适当升高温度，可以增强分子间的热运动，促进鬼臼多糖的溶出。而温度的持续升高会破坏鬼臼多糖的结构并导致其水解，从而降低溶出量和提取率。

从图2c可以看出，随着超声时间（30～150 min）的增加，鬼臼多糖提取率呈现先增加后减小的变化趋势。当超声时间为90 min时，鬼臼多糖提取率达到最大，为36.12%±0.21%。这可能是因为，超声波空化作用可以破坏植物细胞壁，但是随着时间延长，超声波在高温高频率下会破坏鬼臼多糖结构。

从图2d可以看出，随着离子液体质量分数（0.5%～2.5%）的增加，鬼臼多糖提取率呈现先增加后减小的变化趋势。当离子液体质量分数为1.0%时，鬼臼多糖提取率达到最大，为37.23%±0.15%。这可能是因为，适量增加离子液体质量分数能够有效破坏细胞壁，促进细胞壁成分的溶解和裂解，但过高的质量分数会增加提取液的黏度，增加穿透细胞壁的阻力，从而抑制鬼臼多糖的溶出。

2.3 响应面实验结果

2.3.1 实验结果

采用Design Expert 8.06软件对表2中的数据进行二项式拟合，并对模型进行方差分析，得到二项式拟合方程为：

2.3.2 方差分析

方差分析结果如表3所示。从二次多项式拟合结果来看，模型P＜0.0001，表明该拟合模型具有极显著性，失拟项P＞0.05，模型相关系数R2=0.9414，说明二次多项式方程模型对数据拟合度很高，误差小，模型可靠，可作为鬼臼多糖提取的分析测试模型。一次项B、二次项AC、BD对鬼臼多糖提取率有极显著影响（P＜0.01）。由此可知，各影响因素之间的大小关系为B＞A＞D＞C。

2.3.3 响应面分析结果

图3为各因素间交互作用对鬼臼多糖提取率的影响。

从图3a～c可以看出，液料比A、超声温度B和离子液体质量分数D对鬼臼多糖回归方程的线性和二次项均有影响，但交互作用不显著；液料比A和超声时间C对鬼臼多糖回归方程的线性和二次项均有显著影响；从等高线图椭圆形状来看，液料比A和超声时间C的交互作用对鬼臼多糖提取率影响大于液料比A和超声温度B的交互作用以及离子液体质量分数D和料液比A的交互作用。从图3d～f可以看出，超声温度B、超声时间C、离子液体质量分数D的交互作用对鬼臼鬼臼多糖提取率影响为BD＞BC＞CD，这与表3数据相吻合。综上所述，各因素交互作用对鬼臼多糖提取率影响大小排序为：AC＞BD＞BC＞CD＞AB＞AD。根据响应面软件分析，模型优化的最佳工艺条件为：液料比40.525∶1、超声温度52.458 ℃、超声时间91.065 min、离子液体质量分数1.057%，在此条件下鬼臼多糖提取率为37.916%±0.87%，变异系数（RSD）为3.62%。

2.3.4 工艺验证结果

为了便于实验操作，将最优工艺调整为液料比40∶1，超声温度53.0 ℃，超声时间91.0 min，离子液体质量分数1.0%，在此条件下进行3次提取实验，得到鬼臼多糖提取率为37.796%±0.17%，RSD为3.34%。表明该实验模型拟合性良好，可用于鬼臼多糖的提取。

2.4 鬼臼多糖的分离纯化

图4为鬼臼粗多糖的DEAE-650 M柱和Sephadex G-750柱纯化洗脱曲线。

从图4可以看出，鬼臼粗多糖经DEAE-650 M柱分离后得到两个组分，分别为水洗组分和NaCl（0.4 mol/L）盐洗组分（图4a）；经Sephadex G-750凝胶柱进一步纯化，分别得到两个纯化后鬼臼多糖PEP-Ⅰ和PEP-Ⅱ，得率（即纯化后鬼臼多糖的质量与鬼臼粗多糖质量的百分比）分别为32.7%和44.5%。

2.5 表征结果

2.5.1 化学成分测定

经测定，PEP-Ⅰ、PEP-Ⅱ的化学成分及相对分子质量（简称分子量）如下：PEP-Ⅰ重均分子量为27.32 kDa，蛋白质质量分数为0.13%±0.007%，未检测到糖醛酸，表明其为纯度较高的中性鬼臼多糖；PEP-Ⅱ重均分子量为33.48 kDa，蛋白质质量分数为0.37%±0.024%，糖醛酸质量分数为1.93%±0.012%。

2.5.2 单糖组成测定结果

图5为PEP-Ⅰ、PEP-Ⅱ的单糖组成鉴定结果。

从图5可以看出，PEP-Ⅰ主要是由鼠李糖（Rha）、甘露糖（Man）、阿拉伯糖（Ara）、木糖（Xyl）、葡萄糖（Glu）组成，其单糖相对摩尔分数分别为61.85%、19.36%、5.85%、4.77%和8.17%；PEP-Ⅱ主要由岩藻糖（Fuc）、Rha、Ara、Xyl、Glu组成，其单糖相对摩尔分数分别为9.34%、52.89%、12.15%、12.63%和12.99%。两者Rha相对摩尔分数最高。LIU等[25]研究表明，Rha可显著提升小鼠血清抗氧化酶活性以减轻氧化应激，且能降血糖、改善胰岛素敏感性，并修复肝和胰腺组织损伤。

2.5.3 UV-Vis吸收光谱分析

图6为PEP-Ⅰ、PEP-Ⅱ的UV-Vis吸收光谱图。可以看出，PEP-Ⅰ在260 nm处无强吸收峰存在，表明其为纯度较高的中性鬼臼多糖；PEP-Ⅱ在260～280 nm处有一定弱吸收峰，表明其存在微量蛋白质与糖醛酸，这与2.5.1节中的测定结果一致。

2.5.4 XRD分析

图7为PEP-Ⅰ、PEP-Ⅱ的XRD谱图。

从图7可以看出，PEP-Ⅰ、PEP-Ⅱ均在2θ=12°处出现一个较宽的弥散衍射峰，为鬼臼多糖的特征衍射峰；在2θ=30°、42°处出现较宽衍射峰，峰形弥散，表明PEP-Ⅰ、PEP-Ⅱ均存在部分结晶现象，但结晶度较低，是以一种无定形结构存在。此外，谱图中还存在平缓的衍射区域，进一步证实PEP-Ⅰ、PEP-Ⅱ均具有非晶体特征。表明PEP-Ⅰ、PEP-Ⅱ主要以晶体与非晶体复合体系的形式存在。

2.5.5 SEM分析

图8为PEP-Ⅰ、PEP-Ⅱ的SEM图。

从图8可以看出，PEP-Ⅰ表面呈不规则且破碎的形态，部分区域呈网状结构（图8a），可能由于鬼臼多糖分子间的排斥力大于吸引力。PEP-Ⅱ表面呈光滑的片状薄膜，破损程度较轻，边缘有褶皱（图8b），这可能与PEP-Ⅱ较高的鬼臼多糖含量及较强的分子交联程度有关。PEP-Ⅰ、PEP-Ⅱ表面均具有粗糙且致密的特点，其中，PEP-Ⅰ呈海绵状（图8c），这可能是分子链的交织与缠绕形成多孔结构有关；而PEP-Ⅱ呈起伏的山丘状（图8d），可能是由于分子链独特的排列与相互作用。

2.5.6 三螺旋结构分析

图9为PEP-Ⅰ、PEP-Ⅱ的三螺旋结构测定曲线。

多糖的活性与其三螺旋结构之间存在紧密的关联。具有三股螺旋结构的多糖中存在β-1,3-糖残基，可显著提高多糖的抗氧化、降糖活性[26]。从图9可以看出，PEP-Ⅰ、PEP-Ⅱ的最大吸收波长随NaOH浓度增加先升高后降低，表明两者均含有可被高浓度NaOH溶液破坏的三螺旋结构。

2.5.7 TGA分析

图10为PEP-Ⅰ和PEP-Ⅱ的TGA、DTG曲线。

从图10可以看出，PEP-Ⅰ、PEP-Ⅱ的热失重过程可分为3个阶段。第1阶段30.1～136.5 ℃，质量损失分别为9.04%和12.62%，这是由鬼臼多糖分子释放了自由水和结合水所致；第2阶段136.5～330.0 ℃，质量损失显著加快，分别达到70.25%和54.99%。此阶段的质量损失最大，可能是由于高温破坏了鬼臼多糖分子中的碳链和氢键，引发其分解；第3阶段330～600 ℃，PEP-Ⅰ、PEP-Ⅱ在600 ℃时的残炭率分别为20.71%和32.39%，分解速率减缓，表明进入缓慢炭化阶段。结果表明，PEP-Ⅰ、PEP-Ⅱ具有良好的热稳定性，且PEP-Ⅱ的热稳定性优于PEP-Ⅰ。

2.5.8 FTIR分析

图11为PEP-Ⅰ、PEP-Ⅱ的FTIR谱图。

从图11可以看出，PEP-Ⅰ、PEP-Ⅱ显示出相似的特征吸收峰。其中，3342和3338 cm-1处为O—H键的伸缩振动峰；2925和2927 cm-1处为C—H键的伸缩振动峰，这是鬼臼多糖典型的吸收峰。PEP-Ⅰ的FTIR谱图中，1728 cm-1处中强峰为C==O键的伸缩振动；1417 cm-1处弱峰为—CH3的弯曲振动。PEP-Ⅱ在1095 cm-1处弱峰为C—O键的伸缩振动，表明含有糖醛酸结构，与2.5.1节结果一致。此外，1013 cm-1处弱峰为C—O—H和C—O—C键的伸缩振动，表明PEP-Ⅰ、PEP-Ⅱ中均有吡喃环的存在[27]。而928 cm-1处吸收峰表明其可能含有β-糖苷键，833 cm-1处吸收峰则表明其可能含有α-糖苷键。因此，PEP-Ⅰ、PEP-Ⅱ是具有α、β-构型糖苷键的吡喃环结构的鬼臼多糖。

2.5.9 NMR分析

图12为PEP-Ⅰ、PEP-Ⅱ的1HNMR、13CNMR谱图。

从图12可以看出，PEP-I、PEP-Ⅱ在δ 3.0～5.5（1HNMR）和45～110（13CNMR）具有典型鬼臼多糖信号，推测PEP-I和PEP-Ⅱ均包含α、β-构型糖苷键，这与FTIR表征结果一致（图11）。在PEP-Ⅰ的1HNMR谱图中，δ 4.83的强信号为D2O溶剂峰，δ 4.71、5.02分别对应β-1,4-葡萄糖苷键连接的吡喃型葡萄糖基（β-1,4-Glcp）和末端α-呋喃阿拉伯糖基（T-α-Araf）的H-1信号（图12a）。在PEP-Ⅱ的1HNMR谱图中，δ 4.57、5.33分别为β-1,3,4-木吡喃糖基（β-1,3,4-Xylp）和α-1,3-呋喃阿拉伯糖基（α-1,3-Araf）的H-1信号（图12b）[28]。在PEP-Ⅰ的13CNMR谱图中，异头碳区有5个明显信号，分别为δ 110.36、102.47、100.06、99.48和98.67，表明至少存在5种鬼臼多糖残基，与单糖组成分析一致。同时，在δ 170～180范围内未见信号，表明PEP-Ⅰ无糖醛酸，是一种中性鬼臼多糖（图12c）[29]。在PEP-Ⅱ的13CNMR谱图中，δ 108.06、106.40、104.36、102.91和99.87处有5个异头碳信号峰，δ 90处没有其他信号峰出现，表明PEP-Ⅱ鬼臼多糖为吡喃型糖环。

2.6 抗氧化活性分析

图13为PEP-Ⅰ、PEP-Ⅱ对DPPH自由基、ABTS+自由基、羟基自由基的清除率和Fe3+还原能力。

活性氧自由基会攻击分子致新自由基产生，损伤体内大分子，引发多种疾病。而鬼臼多糖含酚羟基，有供氢能力，能清除氧自由基，发挥抗氧化活性[30]。从图13可以看出，质量浓度0.25～8.0 g/L的PEP-Ⅰ、PEP-Ⅱ对DPPH自由基（图13a）、ABTS+自由基（图13b）、羟基自由基（图13c）、Fe3+还原能力（图13d）均呈现一定剂量依赖性。PEP-Ⅱ的体外抗氧化能力高于PEP-Ⅰ，但两者均弱于阳性对照VC。质量浓度8.0 g/L的PEP-Ⅰ对DPPH自由基、ABTS+自由基、羟基自由基清除率分别可达72.54%、75.21%、71.08%，PEP-Ⅱ可达到82.62%、81.57%、78.54%。PEP-Ⅰ对DPPH自由基、ABTS+自由基、羟基自由基的IC50分别为1.832、1.634、1.941 g/L，PEP-Ⅱ的IC50分别为0.734、0.862、0.926 g/L。PEP-Ⅰ、PEP-Ⅱ存在一定的Fe3+还原能力。综上所述，PEP-Ⅰ、PEP-Ⅱ具有一定的抗氧化能力。

2.7 降糖能力分析

图14为PEP-Ⅰ、PEP-Ⅱ对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性抑制能力。

α-葡萄糖苷酶与α-淀粉酶可催化淀粉水解为葡萄糖，促进肠道吸收致血糖上升。抑制这两种酶活性可以减缓碳水化合物向葡萄糖转化速率，进而控制餐后血糖水平[31]。从图14可以看出，质量浓度0.25～8.0 g/L的PEP-Ⅰ、PEP-Ⅱ对α-葡萄糖苷酶抑制率（图14a）和α-淀粉酶抑制率（图14b）具有一定的剂量依赖性。比较而言，PEP-Ⅱ的降糖能力高于PEP-Ⅰ，但两者均低于阳性对照阿卡波糖。质量浓度8.0 g/L的PEP-Ⅰ对α-葡萄糖苷酶抑制率和α-淀粉酶抑制率分别为44.21%和38.63%，IC50分别为3.021、3.242 g/L；质量浓度8.0 g/L的PEP-Ⅱ对α-葡萄糖苷酶抑制率和α-淀粉酶抑制率分别为55.38%和56.67%，IC50分别为2.432、2.398 g/L。表明PEP-Ⅰ、PEP-Ⅱ均具有一定降糖能力。

3 结论

采用超声辅助离子液体提取鬼臼多糖，通过单因素、响应面法优化的最佳提取工艺，考察分离提纯后单一组分PEP-Ⅰ、PEP-Ⅱ的体外抗氧化活性和降糖能力。

（1）鬼臼多糖的最佳提取工艺为：以BMIMCl为离子液体，液料比40∶1，超声温度53.0 ℃，超声时间91.0 min，离子液体质量分数1.0%（以去离子水加入量计）。在此条件下，鬼臼多糖的提取率为37.796%±0.17%。

（2）粗鬼臼多糖经分离纯化，获得的均一组分PEP-I和PEP-Ⅱ的重均分子量分别为27.32和33.48 kDa，两者均含有Rha、Xyl、Glu，是α、β-构型的吡喃型多糖，具有三螺旋构象。PEP-Ⅰ、PEP-Ⅱ在600 ℃时残炭率分别为20.71%和32.39%，表明两者具有良好的热稳定性，其中PEP-Ⅱ的热稳定性优于PEP-Ⅰ。

（3）PEP-Ⅰ、PEP-Ⅱ具有一定的抗氧化能力。质量浓度8.0 g/L的PEP-Ⅰ对DPPH自由基、ABTS+自由基、羟基自由基清除率分别为72.54%、75.21%、71.08%，IC50分别为1.832、1.634、1.941 g/L；质量浓度8.0 g/L的PEP-Ⅱ对DPPH自由基、ABTS+自由基、羟基自由基清除率可达到82.62%、81.57%、78.54%，IC50分别为0.734、0.862、0.926 g/L。

（4）PEP-Ⅰ、PEP-Ⅱ具有一定的降糖活性。质量浓度8.0 g/L的PEP-Ⅰ对α-葡萄糖苷酶抑制率和α-淀粉酶抑制率分别为44.21%和38.63%，IC50分别为3.021、3.242 g/L；质量浓度8.0 g/L的PEP-Ⅱ对α-葡萄糖苷酶抑制率和α-淀粉酶抑制率分别为55.38%和56.67%，IC50分别为2.432、2.398 g/L。

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Extraction, structural characterization and biological activities of Podophyllum emodi polysaccharides

FENG Wei1, LI Jingjie2, LI Ziwei1, LIN Yonggang1*, WANG Junlong1*, SHI Wenpan1

（1. Xinjiang Key Laboratory of Clean Conversion and High Value Utilization of Biomass Resources, Yili Normal University, Yining 835000, Xinjiang, China; 2. Yili Prefecture Traditional Chinese Medicine Hospital, Yining 835000,Xinjiang, China）

Abstract: To facilitate the development and application of Podophyllum emodi polysaccharides (PEP), the crude PEP was extracted by ultrasonic-assisted ionic liquid extraction which was optimized by single factor and response surface methods, and PEP-Ⅰ and PEP-Ⅱ polysaccharides were obtained by column separation and purification, characterized by GPC, XRD, UV-Vis, FTIR, SEM and TGA, and analyzed by anti-oxidation and hypoglycemic experiments in vitro for their biological activities. The results indicated that under the optimal crude PEP extraction conditions of 1-butyl-3-methylimidazole chloride (BMIMCl) as ionic liquid,liquid-solid ratio (mL∶g) 40∶1, ultrasonic temperature 53.0 ℃, extraction time 91.0 min, and ionic liquid mass fraction 1.0% (based on the mass of deionized water, the same below), the extraction yield of crude PEP reached 37.796%±0.17%. PEP-Ⅰ was a neutral pyranose polysaccharide with a weight-average relative molecular mass of 27.32 kDa, characterized by α and β configurations, exhibited a triple helix conformation, and primarily composed of rhamnose (61.85%, relative mole fraction, the same below),mannose (19.36%), and arabinose (5.85%), with an uneven morphological distribution and some portions appearing mesh-like. PEP-Ⅱ was a α and β-configurated acidic pyranose polysaccharide with a weight-average relative molecular mass of 33.48 kDa, predominantly composed of rhamnose (52.89%),xylose (12.63%) and glucose (12.99%), contained trace amounts of protein and uronic acid, and presented as a smooth, plate-like film with minimal fragmentation. Both PEP-Ⅰ and PEP-Ⅱ displayed a crystalline structure coexisting with amorphous phases and exhibited good thermal stability. The maximum half-inhibitory concentration (IC50) of PEP-Ⅰ and PEP-Ⅱ against 1,1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine radical were 1.832 and 0.734 g/L, respectively. The IC50 against 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)radical cation were 1.634 g/L for PEP-Ⅰ and 0.862 g/L for PEP-Ⅱ. For hydroxyl radical, the IC50 were 1.941 g/L for PEP-Ⅰ and 0.926 g/L for PEP-Ⅱ. The IC50 against α-glucosidase were 3.021 g/L for PEP-Ⅰ and 2.432 g/L for PEP-Ⅱ, while for α-amylase, the IC50 were 3.242 g/L for PEP-Ⅰ and 2.398 g/L for PEP-Ⅱ.

Key words: Podophyllum emodi polysaccharides; ionic liquids; ultrasonic extraction; structural characterization;biological activities; modern technology of traditional Chinese medicine

中图分类号：R284.2

文献标识码：A

文章编号：1003-5214 (2026) 01-0132-12

收稿日期：2024-12-27; 定用日期：2025-02-17; DOI: 10.13550/j.jxhg.20240969

基金项目：伊犁科技计划项目（YYD2023A11）；2022伊犁师范大学科研项目（2022YSYY005）

作者简介：冯 薇（2001—），女，硕士生，E-mail：2889811011@qq.com。联系人：蔺永刚（1984—），男，实验师，E-mail：869294906@qq.com；王俊龙（1992—），男，讲师，E-mail：974881461@qq.com。