天然产物具有独特的结构和生理活性多样性，是护肤品的理想成分来源。其中，积雪草具有抗氧化、抗炎、促进创面愈合和抗敏等药效，其主要的活性成分是羟基积雪草苷[1-2]。杨玉琴[3]通过对小鼠体内外代谢研究发现，羟基积雪草苷在发挥药理作用时，起关键作用的成分是低糖苷以及苷元，而积雪草中羟基积雪草双糖苷(MA2G，结构式如下所示）含量极低。ZHANG 等[4]介绍了一种微生物转化法，可以将积雪草转化为MA2G。目前，鲜见关于MA2G 包载技术的报道。

醇质体是在传统脂质体的基础上，加入高浓度的醇而制备得到。高浓度的醇可赋予醇质体良好的流变性和渗透性，有利于促进药物经皮渗透[5-6]。然而，因其高流动性，导致醇质体易出现稳定性差和药物泄漏问题[7]。本课题组[8]前期通过将丙二醇代替部分乙醇制备了一种神经酰胺二元醇质体，发现可以提高囊泡稳定性、包封率和透皮性能，但仍使用乙醇，因此，在化妆品的应用上存在局限性。1,2-丙二醇(PG）和甘油(GL）相比乙醇具有更高的黏度和更低的刺激性，具有更好的应用前景。韩非[9]研究发现，丙二醇和GL 联合使用可以增强脂质体的稳定性，促进药物经皮渗透。

目前研究表明，基于神经酰胺的脂质体可以显著提高药物的经皮渗透，增强脂质体的稳定性[10-12]。本课题组[12]前期仅用单一的神经酰胺(Cer）3 来修饰醇质体发现，单一的Cer3 或Cer6 在水中易结晶析出，在配方中难以稳定存在，但两种Cer 混合时可以形成氢键，显著抑制其单独使用时的结晶析出，与其他脂质具有良好的混融性[13-14]。Cer 能够与角质层脂质中的其他脂质一起形成稳定的脂质双分子层，当脂质以类似于角质层脂质的脂质双分子层的形式给药时，效果更好[15-17]。

本文拟以PG 和GL 代替乙醇、Cer3 和Cer6 修饰醇质体，引入与Cer 具有相同链长的胆固醇(Chol）和硬脂酸(SA），构建了MA2G 神经酰胺醇质体(MCs），以制备更接近角质层脂质组成的稳定脂质体。通过单因素实验优化MCs 配方，并用荧光探针探究PG、GL 和Cer 对MCs 的稳定机理，最后将优化后的配方进行透皮性能考察。以期为增强脂质体的稳定性及药物的透皮性能提供新途径。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

Cer3(质量分数99%）、Cer6(质量分数99%），韩国DOOSAN 公司；卵磷脂(PC60，质量分数60%），河北美亚斯生物技术有限公司；Chol(质量分数99%），北京伊诺凯科技有限公司；MA2G(质量分数95%），江苏瑞霆生物科技有限公司；乙腈，色谱纯，上海泰坦科技有限公司；异硫氰酸荧光素(FITC），AR，上海麦克林生化科技股份有限公司；1,8-苯丙氨基萘磺酸(ANS，质量分数98%）、1,6-二苯基-1,3,5-己三烯(DPH，质量分数98%），美国Sigma 公司；OCT 冰冻切片包埋剂，生物纯，美国Sakura 公司；无水乙醇、SA、PG、GL、磷酸盐缓冲液速溶颗粒(PBS，pH=7.4）、二甲基亚砜(DMSO），AR，国药集团化学试剂有限公司。

Gsonica Q700 型超声波破碎仪，美国Gsonica公司；NanoBrook Omni 型多角度粒度及高灵敏Zeta电位分析仪，美国Brookhaven Instruments 公司；Arc型高效液相色谱仪(HPLC），美国Waters 公司；Talos F200X G2 型场发射透射电子显微镜(STEM）、Nicolet iS50 型傅里叶变换红外光谱仪(FTIR），美国Thermo Fisher Scientific 公司；TK-12D 型透皮扩散试验仪，上海锴凯科技贸易有限公司；F-7000 型荧光分光光度计，日本Hitachi 公司；TCS SP8 X 型激光共聚焦显微镜(CLSM），德国Leica 公司。

1.2 方法

参考文献[18]方法，采用加热超声法制备脂质体，并稍作改动。具体步骤为：保持m(Cer3)∶m(Cer6)=2∶1[14]，首先，将一定量PC60、Chol、SA、Cer(Cer3和Cer6）溶于PG 中，水浴加热升温到80 ℃至溶液澄清透明，得到A 相；其次，将MA2G 溶于GL水溶液中，水浴加热升温到60 ℃至溶液澄清透明，得到B 相；最后，将A 相缓慢地加入B 相中，继续在60 ℃水合反应30 min，得到20 g 粗分散液，再用超声波破碎仪超声处理2 min(开2 s，关2 s，振幅为50 μm），即得分散均匀的MCs(整个体系质量分数为100%，除添加成分外，其余都是去离子水，下同）。

按照MCs 的制备方法和步骤，不添加Cer3、Cer6、Chol 和SA，制备得到MA2G 醇质体(MEs）。将质量分数2%的MA2G 溶解于质量分数20%的PG、质量分数15%的GL 和质量分数63%的去离子水中，制备得到MA2G 分散液(MD）。

1.3 表征与测试

1.3.1 粒径与多分散性指数（PDI）测定

吸取适量MCs 样品，用去离子水稀释后，使用多角度粒度及高灵敏Zeta 电位分析仪在散射角90°、温度25 ℃条件下对MCs 的粒径及PDI 进行测定。

1.3.2 MA2G 包封率测定

MA2G 质量分数采用HPLC 测定：色谱柱为XBridge BEH C18 色谱柱(4.6 mm×150 mm×5 μm）。流动相为V(乙腈)∶V(水)=25∶75，流速1.0 mL/min。检测波长210 nm。进样量10 μL。

参考文献[18]方法测定MCs 中MA2G 包封率，并稍作改动。首先，取一定量MCs 在超滤离心管(截留相对分子质量100 kDa）中，10000 r/min 条件下离心30 min，收集外管液体于10 mL 容量瓶中，用水定容，然后用水系膜过滤(0.22 μm），通过HPLC法测定MA2G 的质量分数(w1），取0.1 mL 的MCs用曲拉通破乳，用水定容至10 mL，然后使用水系膜过滤(0.22 μm），通过HPLC 法测定MA2G 的质量分数(w2）。根据式(1）计算MA2G 包封率(%）。

1.3.3 MCs 膜特性测定

参考文献[19]方法并适当修改。首先配制浓度为8×10–3 mol/L 的ANS/PBS 溶液和浓度为2×10–3 mol/L 的 DPH/四氢呋喃储备液，各量取0.1 mL，分别加入用去离子水稀释50 倍和10 倍的5 mL 脂质体中，混合均匀后，在25 ℃避光条件下水浴30 min。然后，室温下使用荧光分光光度计进行测定。DPH 参数设置为：激发波长(Ex）358 nm，发射波长(Em）425 nm。ANS 参数设置为：Ex=337 nm，Em= 484 nm。狭缝宽度5 nm。在测定过程中，先将样品置于垂直偏振光下得到该荧光的垂直偏振分量(I0,0）和水平偏振分量(I0,90），然后将样品置于水平偏振光下得到该荧光垂直偏振分量(I90,0）和水平偏振分量(I90,90）。最后，根据式(2） ～(4）计算微黏度。

式中：η 为微黏度，a.u.；P 为荧光偏振度；G 为仪器光栅矫正系数。

1.3.4 STEM 测定

用超纯水将MCs 稀释后滴加到铜网上，室温下风干15 min，用滤纸吸去水后室温过夜，使用STEM在加速电压200 kV 下进行观察。

1.3.5 体外透皮实验

参照文献[8]方法并稍作改动。首先，将1 份磷酸盐缓冲液速溶颗粒按照使用说明溶于1 L 去离子水中，配制PBS 溶液(pH=7.4）作为冲洗液。然后，取适量PBS 溶液加入无水乙醇，制成乙醇体积分数20%的乙醇PBS 溶液，作为接收液。

在进行体外透皮实验时，用冲洗液冲洗解冻猪皮，然后放在Franz 扩散池的供给池和接收池之间并固定好。向供给池中分别加入2 mL 的MD、MEs和MCs，并用封口膜密封供给池和接收池。最后，将Franz 扩散池小心地放入透皮扩散试验仪。参数设置为：水浴温度37 ℃，转速200 r/min，透皮时间12 h。

透皮完成后，取出猪皮，用去离子水除去表面残余样品后，再使用滤纸将猪皮表面水吸干。然后用3M 透明胶带将角质层粘贴21 层(1 块胶带粘1 次，用新的胶带重复此操作），并将第1 层除去，其他20 层胶带置于15 mL 离心管中，再加入3 mL 甲醇，超声30 min，用冷冻离心机在5000 r/min 条件下离心 15 min。最后用针管取下清液，经有机滤膜(0.22 μm）过滤后，通过HPLC 测定MA2G 含量，即角质层中MA2G 的含量。

用剪刀将剩余的猪皮剪成小块状，置于离心管中，加入3 mL 甲醇，超声30 min。用冷冻离心机5000 r/min 离心15 min。用针管取上清液，经有机滤膜(0.22 μm）过滤后通过HPLC 测定MA2G 含量，即有活力的表皮和真皮中MA2G 的含量。

取接收液用去离子水稀释一定倍数于离心管中，经有机滤膜(0.22 μm）过滤后通过HPLC 测定接收液中MA2G 的含量。并根据式(5）计算透过率。

式中：MA2G 加入含量为2 mL 的MD、MEs 和MCs中MA2G 的含量。

1.3.6 CLSM 测定

在B 相中加入20 μL 质量浓度1 g/L 的FITC/DMSO 溶液，并按1.3.5 节方法制备用于透皮实验的含FITC 的水醇溶液、醇质体和神经酰胺醇质体。体外透皮实验结束后，用水冲洗猪皮表面，然后用滤纸吸干表面。将猪皮剪成适当宽度，用冷冻包埋剂包裹，于–20 ℃下冷冻。再用冷冻切片机将猪皮切成厚度为20 μm 的薄片，避光保存。最后，将不同样本置于CLSM 下观察，并在激发波长488 nm 下拍摄图像。

1.4 单因素实验

1.4.1 w(PC60)的影响

采用1.2 节MCs 的制备方法和步骤，保持w(PG)=20%、w(GL)=10%、w(Cer)=0.4%、w(Chol)=0.2%、w(SA)=0.2%、w(MA2G)=2%，考察不同 w(PC60)(2%、4%、6%、8%、10%）对MCs 的粒径、PDI和包封率的影响。

1.4.2 w(PG)的影响

采用 1.2 节 MCs 的制备方法和步骤，保持w(PC60)=8%、w(GL)=10%、w(Cer)=0.4%、w(Chol)=0.2%、w(SA)=0.2%、w(MA2G)=2%，考察不同w(PG)(分别为15%、20%、25%、30%、35%）对MCs的粒径、PDI 和包封率的影响。

1.4.3 w(GL)的影响

采用 1.2 节 MCs 的制备方法和步骤，保持w(PC60)=8%、w(PG)=20%、w(Cer)=0.4%、w(Chol)=0.2%、w(SA)=0.2%、w(MA2G)=2%，考察不同w(GL)(分别为0、10%、15%、20%、25%）对MCs 的粒径、PDI 和包封率的影响。

1.4.4 w(Cer)的影响

采用 1.2 节 MCs 的制备方法和步骤，保持w(PC60)=8%、w(PG)=20%、w(GL)=15%、w(Chol)=0.2%、w(SA)=0.2%、w(MA2G)=2%，考察不同w(Cer)(分别为0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%）对MCs的粒径、PDI 和包封率的影响。

1.4.5 w(MA2G)的影响

采用 1.2 节 MCs 的制备方法和步骤，保持w(PC60)=8%、w(PG)=20%、w(GL)=15%、w(Cer)=0.4%，w(Chol)=0.2%、w(SA)=0.2%、考察不同w(MA2G)(分别为0.5%、1%、2%、3%、4%）对MCs 的粒径、PDI 和包封率的影响。

1.5 数据处理

采用SPSS 软件中的ANOVA 方法进行数据分析，数据以“算数平均值±标准偏差”表示，所有实验至少重复3 次(数据显著性P＜0.05）。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果

2.1.1 w(PC60)的影响

图1 为w(PC60)(分别为2%、4%、6%、8%和10%）对MCs 平均粒径、PDI 和包封率的影响。从图1 可以看出，25 ℃下放置30 d 后，w(PC60)=2% ～8%范围内，随着w(PC60)的增大，粒径变化不明显，包封率升高。当w(PC60)=8%时，包封率最高，为68.66%±0.55%。这是因为，w(PC60)越大，形成的囊泡数量越多，越有利于MA2G 的包封。但当w(PC60)=10%时，样品发生团聚，造成药物泄漏[20]，因此，选择w(PC60)=8%制备MCs。

2.1.2 w(PG)和w(GL)的影响

图2和图3分别为w(PG)和w(GL)对MCs 平均粒径、PDI 和包封率的影响。

从图2和图3可以看出，随着w(PG)和w(GL)的增大，MCs 粒径呈先降低后变化缓慢的趋势，包封率呈先升高后降低的趋势。25 ℃下放置30 d 后，当w(PG)>25%、w(GL)>20%后，粒径变化较大，样品不稳定。而当w(PG)=20%、w(GL)=15%时，粒径变化小，包封率最高，为70.57%±0.72%，稳定性好。这是因为，PG 和GL 具有较高的黏度，少量加入时可以增加体系的黏度，防止脂质体聚集，有利于MA2G 的包封，但w(PG)和w(GL)过高时，会造成体系不稳定[9]。因此，选择w(PG)=20%、w(GL)=15%制备MCs。

2.1.3 w(Cer)的影响

图4为w(Cer)对MCs 平均粒径、PDI 和包封率的影响。

从图4 可以看出，25 ℃放置30 d 后，随着w(Cer)的增加，MCs 粒径呈先略微降低后增加的趋势，包封率呈先升高后降低的趋势；当w(Cer)=0.4%时，粒径变化小，包封率最高，为71.38%±0.87%，稳定性好。而w(Cer)增至0.6%后，样品絮凝，粒径变化大。这可能是因为，少量Cer 的加入会与角质层其他脂质(Chol 和SA）以及PC60 共同形成稳定的双分子层结构，当 w(Cer)过高时，脂质体双分子层刚性过高，会造成脂质体破裂[20-21]。因此，选择w(Cer)=0.4%制备MCs，并保持w(Chol)=w(SA)=0.2%。

2.1.4 w(MA2G)的影响

图5为w(MA2G)对MCs 平均粒径、PDI 和包封率的影响。从图5 可以看出，25 ℃放置30 d 后，w(MA2G)=0.5% ～2%范围变化时，粒径和包封率变化不大，这可能是因为，MA2G 主要溶解于水醇介质中。当w(MA2G)>2%后，粒径增大，脂质体部分团聚。这可能是因为，MA2G 被包裹在脂质体内水相时引起渗透压的变化，这种变化可能导致脂质体内部的水分含量发生变化，从而影响脂质体的稳定性，造成药物泄漏。因此，选择w(MA2G)=2%制备MCs。

综合单因素实验，得到MCs 制备的最优条件为：w(PC60)=8%、w(PG)=20%、w(GL)=15%、w(Cer)=0.4%、w(Chol)=0.2%、w(SA)=0.2%、w(MA2G)=2%。在此条件下新制备的MCs 为黄色透明液体，平均粒径为(53.24±1.2) nm，PDI 为0.195±0.012，包封率为72.17%±1.25%。

2.2 w(PG)、w(GL)、w(Cer)对MCs 微黏度的影响

图6为w(PG)、w(GL)、w(Cer)对MCs 微黏度的影响。

脂质体的稳定性与双分子层膜的流动性之间存在紧密的关联，膜的流动性是衡量脂质体稳定性的一个重要指标[22]。微黏度被认为与膜流动性成反比，即微黏度越大，膜流动性越小，脂质体越稳定[23]。而荧光探针ANS 和DPH 常用于评估膜的流动性。ANS 与磷脂的磷酸基团结合，吸附在脂质体膜与水相环境的界面上，间接反映脂质体膜表面黏度的变化；DPH 位于双分子层的疏水区，可以反映脂质体疏水区的微黏度[24]。

从图6 可以看出，随着w(PG)和w(GL)的增加，MCs 双层膜的微黏度先增大后减小，这可能是由于，w(PG)和w(GL)较少时会形成氢键来稳定脂质体，但过多地加入会破坏膜结构，增加疏水区域降低稳定性[25]。从图6 还可以看出，随着w(Cer)从0 增加到0.4%，双层膜膜表面和疏水区的微黏度均显著增加，膜流动性降低。这表明Cer 可能与磷脂共同形成双分子层结构，Cer 的加入导致脂质体中双层膜分子之间的相互作用增强，膜内堆积密度增加，稳定性增强。但w(Cer)过高，膜的刚性过高，则可能会导致膜内产生横向分离，膜密度下降，流动性增加，稳定性降低[26-27]。

结果表明，当w(PG)=20%、w(GL)=15%、w(Cer)=0.4%时，脂质体的膜微黏度高，流动性低，稳定性较好，这与脂质体25 ℃下储藏30 d 稳定性结果一致。

2.3 MCs 表征结果

图7为最优条件下制备的MCs 的STEM 图及其粒径分布直方图。从图7 可以看出，MCs 呈规则且均一的球状囊泡，粒径在40 ～70 nm(图7a），与粒径测试结果(图7b）一致。

2.4 MCs 的体外透皮性能

图8为用MD、MEs 和MCs 处理后猪皮中MA2G的透过率。

从图8可以看出，与MD 相比，MEs 和MCs都具有更好的皮肤渗透性，并且Cer 修饰的MCs 能够进一步提高皮肤透过率。其中，MA2G 的总皮肤透过率由 MD 的 6.25%±0.18%增加至 MEs 的10.68%±0.62%和MCs 的14.47%±0.12%。这是因为，与水醇溶液相比，醇质体诱导的活性成分的渗透增强作用更强[28-29]。Cer 修饰可进一步提高药物的皮肤透过率，一方面是由于Cer 修饰后会使醇质体粒径减小、包封率提高、膜微黏度及稳定性提高，从而使其皮肤穿透率提高；另一方面是因为，Cer 是角质层细胞间脂质，Cer 修饰后醇质体可以更好地与皮肤融合，从而将更多的药物渗透到皮肤深层[30]。

图9是用MD、MEs 和MCs 处理后猪皮的CLSM图像。

从图9可以看出，FITC 分散液只停留在皮肤最外层的角质层(图9a1、a2），而FITC 醇质体(图9b1、b2）和FITC 神经酰胺醇质体(图9c1、c2）在皮肤中的荧光强度和透皮深度显著增加，FITC 神经酰胺醇质体的渗透深度最大，表明MCs 对MA2G 的促渗效果最好。这些结果与HPLC 结果一致。

3 结论

选取PG、GL 和Cer(Cer3 和Cer6）对传统脂质体进行修饰，并引入与Cer 相同碳链长度的Chol和SA，成功构建了MA2G 神经酰胺醇质体(MCs）。

(1）MCs 制备的最优条件为：w(PC60)=8%，w(PG)=20%，w(GL)=15%，w(Cer)=0.4%，w(Chol)=0.2%，w(SA)=0.2%，w(MA2G)=2%。

(2）优化条件制备的MCs 为黄色透明液体，平均粒径(53.24±1.2) nm，PDI 为0.195±0.012，包封率为72.17%±1.25%，微黏度高；SEM 结果也显示，其为规则且均一的球状囊泡，粒径在40 ～70 nm。

(3）MCs 处理后猪皮中MA2G 的总皮肤透过率为14.47%±0.12%。这主要是因为，Cer 与皮肤有良好的融合能力，可以将更多的活性物质带到皮肤深层，促进渗透。

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Preparation of madecassoside derivative ceramide ethosomes and its skin penetration properties

PU Meiling1,2, LIANG Rong1,2*, ZHAO Bingtian1,2, YANG Cheng1,2
(1. School of Chemical ＆ Material Engineering, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China; 2. Key Laboratory of Synthetic and Biological Colloids, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China）

Abstract: In order to improve the bioavailability of centellasaponin B (MA2G), MA2G ceramide liposomes (MCs) were constructed from modification of conventional liposomes with propylene glycol(PG), glycerol (GL) and ceramide (Cer). The influence of formulation component content on average particle size, polydispersity index (PDI), and encapsulation rate of MCs were analyzed by particle size test and HPLC characterization, while the stabilization mechanism of MCs was explored by fluorescent probe test, and the transdermal properties were evaluated via HPLC and confocal laser microscopy. The results showed that PG, GL and Cer could improve the stability of MCs by increasing the microviscosity of liposomal membrane. Under the condition of w[lecithin (PC60)]=8%, w(PG)=20%, w(GL)=15%,w(Cer)=0.4%, w(cholesterol)=0.2%, w(stearic acid)=0.2% and w(MA2G)=2%, the MCs obtained were yellow transparent liquid, with an average particle size of (53.24±1.2) nm, PDI of 0.195±0.012, and encapsulation rate of 72.17%±1.25%, showing high microviscosity. STEM results revealed that MCs were regular and homogeneous spherical vesicles with particle sizes ranging from 40 to 70 nm. Compared with the MA2G dispersions, the MCs exhibited a better skin permeability, with the total skin permeability increased from 6.25%±0.18% to 14.47%±0.12%. The Cer in MCs had a good fusion ability with the skin,which could bring more active substances to the deeper layers of the skin and promote penetration.

Key words: centellasaponin B; ceramide; liposomes; microviscosity; transdermal properties; drug materials

中图分类号: R943；TQ658

文献标识码: A

文章编号: 1003-5214 (2025) 12-2734-08

收稿日期: 2024-12-30; 定用日期:2025-01-09;

DOI: 10.13550/j.jxhg.20240975

基金项目: 国家重点研发计划项目(2016YFD0400801）

作者简介: 蒲美玲(2000—），女，硕士生，E-mail：1670970731@qq.com。联系人:梁 蓉(1983—），女，副教授，E-mail：rongliang@jiangnan.edu.cn。