胃溃疡是一种全球发病率较高的胃部疾病[1-2]。胃黏膜损伤引发的胃溃疡常常与过度饮酒、吸烟等不良生活习惯有关，也会因为情绪低落、感染幽门螺旋杆菌以及长期服用非甾体抗炎药物而导致[3]。慢性氧化应激的增加已成为胃部病理的主要标志，对多种胃病的发展具有重要影响[4]。在生理状态下，胃上皮细胞中源自胃腔内的物理、化学或微生物因素的活性氧（ROS）水平较高，远超过其他组织或体液中的水平[5]。ROS 过量积累会引发细胞凋亡、坏死以及其他形式的氧化性损伤，并导致氧化应激[6]。因此，针对氧化应激及其相关途径的改善措施对于多种胃部疾病的治疗具有广泛的适用性。

富勒烯（C60）是一种完全由碳组成的中空分子，是众多碳纳米材料中一种独特的同素异形体，具有特殊的p-π 共轭结构。富勒烯可通过碳碳双键吸附自由基[7]，具有良好的抗氧化性和细胞保护能力[8-9]，可用于药物负载和炎症治疗[10-11]。基于富勒烯易团聚的特性，研究人员通过液-液界面沉淀（LLIP）法简单制备了具有不同尺寸、形态和表面反应活性的富勒烯聚集体[12-13]。该法为富勒烯在纳米载体领域的应用提供了新的可能，拓展了其在生物医学领域的应用前景。研究发现，富勒烯可以保护结肠直肠组织免受乙酸、二硝基苯磺酸、葡聚糖硫酸钠盐等化学药物的损伤，通过清除ROS 自由基，预防溃疡性结肠炎的诱发[14-15]。但针对富勒烯缓解胃溃疡的研究很少，其对胃黏膜细胞的氧化应激相关损伤是否具有保护活性仍未知。

本文拟通过LLIP 法制备尺寸可控的包载L-半胱氨酸（L-Cys）的氨基化富勒烯中空球聚集体（L-Cys@NFH），并对其化学结构和形貌进行表征。进一步使用H2O2 建立胃溃疡炎症氧化应激模型，考察L-Cys@NFH 对氧化应激诱导的人胃黏膜（GES-1）细胞损伤的保护效果[16]。以期为新型胃溃疡治疗药物的开发提供参考。

1 实验部分

1.1 材料、试剂与仪器

模拟胃液，上海麦克林生化科技股份有限公司；GES-1 细胞，北京北纳创联生物技术研究院；胰蛋白酶、磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH=7.4）、DMEM培养基，美国Thermo Fisher Scientific 公司；胎牛血清，美国HyClone 公司；CCK-8 试剂盒，上海碧云天生物技术股份有限公司。

富勒烯（质量分数99.9%），南京牧科纳米科技有限公司；L-半胱氨酸（L-Cys，质量分数99%），北京百灵威科技有限公司；乙二胺（EDA）、H2O2（质量分数30%）、浓盐酸（质量分数36%~38%）、甲苯、异丙醇（IPA），分析纯，国药集团化学试剂有限公司；奥美拉唑（OME，质量分数98%），上海源叶生物科技有限公司；2,2'-联苯基-1-苦基肼基（DPPH），上海麦克林生化科技股份有限公司；5,5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物（DMPO），上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

Nicolet iS5 型傅里叶变换红外光谱仪（FTIR），美国Thermo Fisher Scientific 公司；AXIS Supra 型X射线光电子能谱仪（XPS），英国Kratos 公司；JEM-2010F 型透射电子显微镜（TEM），日本电子株式会社；S-4800 型扫描电子显微镜（SEM），日本 Hitachi 公司；NanoBrook Omni 型粒径分析仪（DLS），美国布鲁克海文仪器公司；TU-1950 型紫外-可见分光光度计（UV-Vis），北京谱析通用仪器有限责任公司；Spectra Max M2 型酶标仪，美谷分子仪器（上海）有限公司；Vario MACRO Cube 型元素分析仪（EA），德国Elementar 公司；EMXnano型电子顺磁共振波谱仪（EPR），德国Bruker 公司。

1.2 方法

向0.05 mL L-Cys 水溶液（质量浓度为20 g/L）中依次加入0.5 mL 乙二胺和0.95 mL 异丙醇，摇匀后得到L-Cys 混合液；将上述L-Cys 混合液加入到4 mL 质量浓度为0.5 g/L 的富勒烯甲苯溶液中，摇匀静置孵育3 h，有棕褐色沉淀析出；然后，将溶液离心6 min（4000 r/min），以使包载半胱氨酸的富勒烯中空球充分分离；最后，将得到的沉淀置于真空烘箱内干燥24 h（–1 MPa，65 ℃），将制得的包载半胱氨酸的氨基富勒烯中空球聚集体记为L-Cys@NFH。

按照L-Cys@NFH 的制备方法和步骤，固定其他条件不变，调整L-Cys 水溶液为去离子水，制备氨基富勒烯纳米球聚集体，记为NFH。

1.3 结构表征与性能测试

FTIR 测试：KBr 压片法，波数范围4000~500 cm–1，分辨率4 cm–1，扫描次数32 次[17]。XPS 测试：Al Kα为射线源，并以C 1s（284.8 eV）为基准对数据进行校正。EA 测试：(2.0±0.2) mg 样品干燥研磨后，使用元素分析仪测定C、N、S 元素质量分数。裂解炉梯度升温（950~1200 ℃，升温速率30 ℃/s）。SEM测试：样品喷金，低位二次电子（LEI）模式，工作电流20 μA，电子加速电压5.0 kV。TEM 测试：工作电压200 kV，分辨率0.24 nm，放大倍数1.1×106倍，加速电压200 kV，点分辨率0.19 nm，线分辨率0.1 nm，最小束斑尺寸0.2 nm。EDS 测试：对L-Cys@NFH 的特定区域实施元素分析面扫，全方位确定其中所含元素种类及其分布。DLS 测试：测定质量分数为0.1%的聚集体水合粒径，测试条件为：温度 25 ℃、散射角90°。UV-Vis 测试：扫描波长200~600 nm。载药率和包封率用式（1）、（2）计算：

式中：L 为载药率，%；n2 为富勒烯分子上乙二胺分子的接枝数；n1 为聚集体半胱氨酸物质的量与富勒烯物质的量的比值；E 为包封率，%。

1.4 自由基清除能力实验

参照文献[18] 测试L-Cys@NFH 的DPPH 自由基清除能力。将2 mg DPPH 溶于50 mL 无水乙醇中，避光4 ℃保存。实验组：100 μL DPPH 溶液+100 μL不同质量浓度（12.5、25、50、100、200 mg/L）L-Cys@NFH 水分散液。对照组：100 μL DPPH 溶液+100 μL 去离子水。空白组：100 μL 无水乙醇+100 μL梯度质量浓度样品。涡旋混匀，室温避光反应30 min。用酶标仪测定溶液在517 nm 处的吸光度（As：实验组；Ac：对照组；Ab：空白组），每组3次平行。根据式（3）计算DPPH 自由基清除率（%）：

以DMPO 作为自旋捕获剂，EPR 检验L-Cys@NFH的羟基自由基（•OH）清除能力。DMPO 母液配制：将10.8 mg DMPO 溶于1 mL 超纯水中。测试组：60 μL DMPO+30 μL 浓度 1 mol/L H2O2+30 μL L-Cys@NFH 水分散液。空白组：60 μL DMPO+30 μL H2O2+30 μL 超纯水。将样品注入石英毛细管（内径1 mm），在500 W 紫外光下距离毛细管12 cm 处垂直照射4 min。避光条件下立即测试，记录5,5-二甲基-1- 吡咯啉-N- 氧化物- 羟基自由基加合物（DMPO-OH）的X 波段EPR 光谱。

1.5 细胞毒性测试

以GES-1 为模型，通过CCK-8 法测试L-Cys@NFH的细胞毒性[19]。

样品组：将GES-1 以1×104 个/孔接种于96 孔板中，在DMEM++培养基（完全培养基，在DMEM中加入质量分数为·10%的胎牛血清和质量分数为1%的青霉素/链霉素双抗溶液）中培养24 h；然后，去除培养基，加入不同质量浓度（200、100、50、25、12.5 mg/L）的样品DMEM 分散液，再孵育24 h；除去培养基，PBS 冲洗2 次；最后，将质量分数为10%的CCK-8 溶液与细胞共孵育1 h，用酶标仪测量其在450 nm 处的吸光度。

对照组采用纯DMEM 代替样品溶液，其他条件与样品组一致；样品（空白）组不接种细胞，其他条件与样品组一致；对照（空白）组不接种细胞，且用纯DMEM 代替样品溶液，其他条件与样品组一致。根据式（4）计算细胞活力（%）：

式中：、、、 分别为样品组、样品（空白）组、对照组、对照（空白）组的吸光度。

1.6 细胞划痕实验

将GES-1 细胞以2×105 个/孔接种于6 孔板中，在DMEM++培养基中培养至形成单层细胞。用移液枪枪头（灭菌）划痕，完成后使用无菌PBS 洗细胞2~3 次。去除划下的细胞，使留下的间隙肉眼清晰可见。除空白组外，其余3 组分别加入质量浓度50 mg/L 的L-Cys、NFH 和L-Cys@NFH 分散液处理细胞。将细胞放入37 ℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养，24 和48 h 后取出，借助倒置显微镜监测不同时间点的细胞状态，并使用Image J 软件计算不同时间点的细胞间隙面积。根据式（5）计算间隙闭合率（%）：

式中：Sa、Sb 分别为细胞在CO2 培养箱中培养前后的间隙面积（µm2）。

1.7 抗炎能力测试

1.7.1 炎症氧化应激模型建立

参照文献[20] 方法建立H2O2 氧化应激模型。将GES-1 细胞以1×104 个/孔接种于96 孔板中，在100 µL DMEM++培养基中培养24 h。移去DMEM++培养液，每孔加入 100 µL 含有 H2O2（0.2~1.0 mmol/L）的DMEM 溶液干预细胞12 h。除去溶液后，用PBS 冲洗2 次，加入质量分数为10%的CCK-8 的DMEM 溶液，孵育1 h。用酶标仪测量H2O2 干预细胞的样品组、未加H2O2 的对照组和单纯DMEM/CCK-8 混合的空白组在450 nm 处的吸光度。根据式（6）计算细胞存活率（%）：

式中：、、 分别为样品组、空白组、对照组的吸光度。

1.7.2 抗炎效果测试

将细胞分为对照组（C）、模型组（M）、L-Cys@NFH保护组、L-Cys 保护组、NFH 保护组和阳性药物OME保护组。

将GES-1 细胞以1×104 个/孔接种于96 孔板中，在 100 µL DMEM++培养基中培养 24 h。移去DMEM++培养液，在对照组和模型组加入100 µL DMEM 溶液，在L-Cys@NFH 组、L-Cys 组、NFH组和OME 组中分别加入质量浓度为50 mg/L 的样品DMEM 溶液，预保护12 h，除去溶液后用PBS 冲洗2 次；对照组每孔加入100 µL DMEM 溶液；其余每孔加入100 µL 含H2O2（0.8 mmol/L）的DMEM 溶液干预细胞12 h。除去溶液，用PBS 清洗2 次；最后，加入质量分数为10%的CCK-8 的DMEM 溶液，孵育1 h，用酶标仪测定溶液在450 nm 处的吸光度。根据式（6）计算细胞存活率。

1.8 数据处理

所有统计分析均使用Prism 8.0.2（GraphPad，美国），数据来自至少3 个独立实验，并使用Origin作图。P<0.05（*）、P<0.01（**）、P<0.001（***），分别表示数据在统计学上具有差异显著性、差异特别显著、差异极其显著。

2 结果与讨论

2.1 样品的表征

2.1.1 FTIR 分析

图1 为NFH 和L-Cys@NFH 的FTIR 谱图。

从图1 可以看出，在NFH 的FTIR 谱图中，3414、1648 和1108 cm–1 处的吸收峰分别归属于N—H 键的伸缩振动、弯曲振动和C—N 键的伸缩振动，表明富勒烯的成功氨基化[13]；2934 和1447 cm–1 处为本征富勒烯的==C—H、C—C 键的拉伸振动，表明富勒烯的大部分 sp2 结构被保留了下来[13]。在L-Cys@NFH 的FTIR 谱图中，2516 cm–1 处为—SH的吸收峰[21]，表明半胱氨酸已成功包载在氨基化富勒烯中空球聚集体内部。

2.1.2 XPS 分析

图2 为L-Cys@NFH 的XPS 谱图。

从图2a 可以看出，结合能163.5、284.8、398.8和531.9 eV 处的4 个峰分别归属于S、C、N 和O。

从图2b 可以看出，结合能284.6 eV 处的峰归属于C==C；285.6 eV 处的峰归属于有缺陷的C—C[22]。在较高的结合能下，存在含氧官能团的特征峰：C—O/C—N/C—S（286.5 eV）、C==O（287.6 eV）和C(O)OH/R（288.9 eV）。结合能290.2 eV 处存在由π-π*跃迁引起的低强度峰[23]，表明L-Cys@NFH表面存在大量含氮基团。

从图2c 可以看出，L-Cys@NFH 的N 1s 谱图可分解为结合能398.8、399.9 和401.2 eV 处的3 个峰，分别对应于C—N、—NH2 和—N—H。这些谱带是乙二胺将N 原子引入到富勒烯结构（C60—N）中所致，表明，乙二胺已成功接枝富勒烯。

从图2d 可以看出，S 2p3/2 和S 2p1/2 峰分别位于结合能163.5 和164.8 eV 处，这与半胱氨酸的硫醇基团有关。结合能167.7 eV 处的峰可能是由氧化硫物质（S==O 键）引起的[24]。

2.1.3 EA 分析

通过EA 分析进一步验证三者的分子结构。参照文献[13] 计算方法，通过化合物中C 和N 元素的质量分数计算L-Cys@NFH 中接枝的乙二胺物质的量，通过化合物中N 和S 元素的质量分数计算L-Cys@NFH中半胱氨酸的包封率。表1 为L-Cys@NFH 的元素和成分组成。

从表1 可以看出，富勒烯分子上乙二胺分子的接枝数为6.64，聚集体半胱氨酸物质的量与富勒烯物质的量的比值为 2.93。通过计算得到载药率为24.16%，包封率为65.23%。

2.1.4 SEM 和TEM 分析

图3 为L-Cys@NFH 的SEM 图、粒径分布图、TEM 图和壁厚分布图。

从图3 可以看出，L-Cys@NFH 呈现高度单分散的纳米球聚集体形貌（图3a），聚集体平均粒径553 nm（图3b）。L-Cys@NFH 具有明确的中空结构（图3c），是通过LLIP 法聚集形成的中空球状聚集体，表面其平均壁厚为123 nm（图3d），这种均一的纳米级壁厚可能会赋予材料优异的机械稳定性。

图4为通过DLS 测定的质量分数为0.1%的水分散体系中L-Cys@NFH 的流体力学直径分布。

从图4 可以看出，L-Cys@NFH 平均粒径为559 nm，与SEM 统计结果（553 nm）高度吻合，结果表明，L-Cys@NFH 在液相环境中能维持稳定的聚集态结构[25-26]。

2.1.5 EDS 分析

图5 为L-Cys@NFH 的扫描透射电子显微镜（STEM）及EDS mapping 图。

从图5 可以看出，C、N 元素均匀分布在球壳内，表明半胱氨酸能够很好地被中空球结构负载[27]。

2.1.6 UV-Vis 分析

图6 为L-Cys@NFH 的UV-Vis 吸收光谱。

从图6 可以看出，当L-Cys@NFH 分散液的质量浓度为200 mg/L 时，其最大吸光度可达1.5 以上。另外，UV-Vis 吸收光谱中没有观察到特征峰，这是由于sp2 杂化结构减弱，再次证实几乎所有的富勒烯分子都转化为氨基富勒烯[25]。改性后的L-Cys@NFH水分散液的分散性显著优于本征富勒烯（内插图），表明制备的L-Cys@NFH 在水中具有优良的分散性能。

2.2 自由基清除能力分析

图7 为质量浓度对L-Cys@NFH 的DPPH 自由基清除率的影响及采用EPR 技术评估L-Cys@NFH的•OH 清除能力结果。

从图7a 可以看出，质量浓度为12.5 mg/L 时，L-Cys@NFH 的DPPH 自由基清除率仅为5.2%；而质量浓度提升到200 mg/L 时，DPPH 自由基清除率提升至85%以上。

从图7b 可以看出，以DMPO 为自旋捕获剂，测得200 mg/L 处理组的EPR 信号强度比空白组降低了 66.1%（即•OH 清除率为 66.1%），表明L-Cys@NFH 具有高效的•OH 清除能力[28]。

2.3 结构稳定性分析

图8 为不同pH 条件下L-Cys@NFH 的SEM 图。

从图8 可以看出，L-Cys@NFH 在模拟胃液（pH=1.2）中结构完整性随时间（1、2 h）的增加而被破坏（图8a、b），而在PBS 溶液（pH=7.4）中随时间（1、2 h）增加稳定存在（图8c、d），表明L-Cys@NFH 的结构具有显著的pH 响应性[29]。

2.4 生物安全性和修护性分析

图9 为L-Cys@NFH 的质量浓度对细胞活力的影响。

从图9 可以看出，随着L-Cys@NFH 质量浓度的升高，细胞活力逐渐从 96.8%降至 86.5%。当L-Cys@NFH 质量浓度控制在≤50 mg/L 时，GES-1细胞存活率稳定保持在95%左右，显示出良好的生物相容性[30]。然而，当L-Cys@NFH 质量浓度≥100 mg/L 后，GES-1 细胞活力则显著降至<90%。因此，后续实验采用质量浓度为50 mg/L 的L-Cys@NFH进行实验。

图10 为质量浓度为50 mg/L 的L-Cys、NFH、L-Cys@NFH 处理GES-1 细胞后的迁移测试结果。图11 为不同组细胞迁移48 h 后的间隙闭合率。

从图10 可以看出，L-Cys@NFH 能够改善GES-1细胞的迁移效果，随着时间的推移，与未处理的细胞相比，L-Cys@NFH 显著加速了GES-1 细胞的伤口闭合（P<0.001）（图11），闭合率为82%，效果优于 NFH（P<0.05）和 L-Cys。结果表明，L-Cys@NFH 中的氨基化富勒烯与半胱氨酸可以协同增效促进细胞闭合。

2.5 细胞损伤防护作用分析

图12 为不同浓度H2O2/DMEM 溶液的细胞毒性测试结果。

为建立稳定的氧化应激模型，通过预实验筛选H2O2 处理浓度，细胞存活率需控制在50%~70%范围内[31]。细胞存活率>70%时，氧化应激效应不足，细胞存活率<50%时，细胞发生不可逆损伤。从图12可以看出，在浓度为0.8 mmol/L 的H2O2/DMEM 溶液共培养12 h 后，GES-1 细胞存活率为61.8%。因此，确定浓度0.8 mmol/L 的H2O2/DMEM 溶液处理GES-1细胞12 h 为最佳建模条件，进一步探索L-Cys@NFH对H2O2 诱导细胞损伤的保护作用[32]。

图13为L-Cys@NFH、OME、L-Cys、NFH 对GES-1 细胞的防护作用测试结果。

从图13 可以看出，用质量浓度为50 mg/L 的L-Cys@NFH、OME、L-Cys、NFH 预保护12 h，再经浓度0.8 mmol/L 的H2O2/DMEM 溶液处理12 h后，L-Cys@NFH 组和OME 组的GES-1 细胞存活率从61.8%分别升高至100%和87.5%，而L-Cys 组和NFH 组的GES-1 细胞存活率分别仅升至83.2%和84.9%，较模型组（M 组）并无显著性差异，表明L-Cys@NFH 的协同增效作用能够有效预防H2O2 引起的细胞损伤[20]。

3 结论

（1）通过优化液-液界面沉淀法，在乙二胺参与的氨基化反应体系中实现富勒烯-半胱氨酸复合物的一步自组装，成功构建了具有单分散特性的中空球聚集体L-Cys@NFH。

（2）L-Cys@NFH 平均粒径为553 nm，其表面平均壁厚为 123 nm。质量浓度为 200 mg/L 的L-Cys@NFH 的DPPH 自由基清除率>85%，•OH 清除率为66.1%。

（3）L-Cys@NFH 具有良好的生物相容性和促进胃黏膜细胞迁移的能力。L-Cys@NFH 质量浓度为12.5~200 mg/L 时无明显细胞毒性；在质量浓度为50 mg/L 的L-Cys@NFH 干预下，GES-1 细胞的间隙闭合率达到82%。

（4）L-Cys@NFH 具备保护胃黏膜细胞抵御ROS、预防H2O2 引起的细胞损伤的功能。质量浓度为50 mg/L 的L-Cys@NFH 保护下的GES-1 细胞存活率为100%。

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Preparation of cysteine-loaded hollow spherical fullerene aggregates for protection on gastric epithelial cells

ZHANG Liqing1,2, ZHANG Qiong1,2, HONG Liu1,2*, YANG Cheng1,2
（1. School of Chemical and Material Engineering, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China; 2. Key Laboratory of Synthetic and Biological Colloids, Ministry of Education, Wuxi 214122, Jiangsu, China）

Abstract：Hollow spherical aminated fullerene aggregates encapsulating L-cysteine (L-Cys) (L-Cys@NFH)were prepared from ethylenediamine (EDA)-modified fullerene (C60) by liquid-liquid interfacial precipitation (LLIP) method, and characterized by FTIR, XPS, EA, SEM, TEM and EDS. The biocompatibility and cell migration ability of L-Cys@NFH on human gastric mucosal cells (GES-1 cells)were analyzed by cytotoxicity tests and in vitro scratch assays, while the protective performance of L-Cys@NFH on GES-1 cells was evaluated by hydrogen peroxide (H2O2)-induced oxidative stress model.The results showed that L-Cys@NFH exhibited monodisperse properties with an average particle size of 553 nm and an average wall thickness of 123 nm. The scavenging rate of L-Cys@NFH with a mass fraction 200 mg/L for 2,2'-diphenyl-1-picrylhydrazyl free radical exceeded 85%, and that for •OH was 66.1%.L-Cys@NFH showed no significant cytotoxicity at mass concentrations of 12.5~200 mg/L. The scratch closure rate of GES-1 cells treated with 50 mg/L L-Cys@NFH reached 82%, with the cell survival rate reaching 100%. L-Cys@NFH protected GES-1 cells against reactive oxygen species and prevented H2O2-induced cellular damage.

Key words：aminated fullerene; hollow spheres; cysteine; gastric ulcer; oxidative stress; functional materials

中图分类号：TQ460.1；R965

文献标识码：A

文章编号：1003-5214 (2026) 02-0300-08

收稿日期：2025-01-13; 定用日期：2025-03-03; DOI：10.13550/j.jxhg.20250040

基金项目：江苏省自然科学基金项目（BK2017175）

作者简介：张立青（2000—），男，硕士生，E-mail：2585395593@qq.com。联系人：洪 流（1985—），男，副教授，E-mail：hongliu@jiangnan.edu.cn。